Plastoglobül Lipid Damlacığı İzolasyonu Bitki Yaprağı Dokusu ve Siyanobakterilerden
Summary
Çeşitli fotosentetik organizmalarla ilişkili plastoglobül lipid damlacıklarının izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmaktadır. İzole plastoglobüllerin başarılı bir şekilde hazırlanması, proteomik ve lipidomik analizler gibi ayrıntılı moleküler araştırmalardan önce gelen çok önemli bir ilk adımdır.
Abstract
Plastoglobül lipit damlacıkları, bitki kloroplastlarının ve siyanobakterilerin dinamik bir alt bölmesidir. Fotosentetik türler arasında her yerde bulunan, hızla değişen çevresel koşullar altında tilakoid membranın adaptasyonunda ve yeniden şekillenmesinde merkezi bir rol oynadığına inanılmaktadır. Yüksek saflıktaki plastoglobülleri izole etme kapasitesi, proteomik, lipidomik ve diğer metodolojiler yoluyla çalışmalarını büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Yüksek saflık ve verime sahip plastoglobüllerle, diğer olası moleküler özelliklerin yanı sıra lipit ve protein bileşimlerini, enzimatik aktivitelerini ve protein topolojilerini araştırmak mümkündür. Bu makalede, plastoglobüllerin bitki yaprağı dokusunun kloroplastlarından izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmakta ve plastoglobüllerin ve ilgili lipit damlacık yapılarının mısır yapraklarından, diriliş bitkisinin kurutulmuş yaprak dokusundan, Eragrostis nindensis’ten ve siyanobakteri, Synechocystis’ten izolasyonu için metodolojik varyasyonlar sunulmaktadır. sp. PCC 6803. İzolasyon, bu lipit bakımından zengin parçacıkların düşük yoğunluğuna dayanır ve bu da sakkaroz yoğunluğu yüzdürme ile saflaştırmalarını kolaylaştırır. Bu metodoloji, çeşitli türlerden plastoglobüllerin incelenmesinde değerli olduğunu kanıtlayacaktır.
Introduction
Plastoglobül kompozisyonu ve fonksiyonunun güncel anlayışı ayrıntılı proteomik ve lipidomik çalışmalarla ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5. Bu tür çalışmalar, sakkaroz gradyanları kullanılarak verimli ayırma için çok düşük yoğunluklarına dayanan hızlı ve etkili bir izolasyon yöntemi ile büyük ölçüde desteklenmiştir. Plastoglobul izolasyonunun ilk yöntemleri, kayın ağacı (Fagus sylvatica), viski süpürgesi (Sarothamnus scoparius), soğan (Allium cepa), ıspanak (Spinacia oleracea), hercai menekşe (Viola tricolor), biber (Capsicum annuum) ve bezelye (Pisum sativum) 6,7,8,9,10,11 gibi türlerden elde edildi. ,12,13. Kloroplast plastoglobülleri daha verimli ve daha iyi verimli bir şekilde izole etmek için güncellenmiş bir yöntem daha sonra Ytterberg ve ark.3,14 tarafından sunulmuştur. Başlangıçta Arabidopsis thaliana yaprak kloroplastlarının plastoglobüllerinin incelenmesi için kullanılırken, bu güncellenmiş yöntemi, mısır (Zea mays), domates (Solanum lycopersicum), lovegrass (Eragrostis nindensis), mor sahte brom (Brachypodium distachyon) ve yabani tütün (Nicotiana benthamiana) dahil olmak üzere hem monokot hem de dikot gibi diğer bitki türlerinin sağlıklı yaprak dokusu için başarıyla kullandık. ; yayınlanmamış sonuçlar). Ayrıca, izolasyon yöntemi, Synechocystis sp. PCC 6803 ve Anabaena sp. PCC 712015 ve diriliş bitkisinin kurutulmuş yaprak dokusu E. nintensis dahil olmak üzere siyanobakterilerin plastoglobüllerine başarıyla uyarlanmıştır.
Sağlıklı yaprak dokusunun kloroplast plastoglobülleri tilakoid membranlara fiziksel olarak bağlıdır16. Bu fiziksel sürekliliğe rağmen, iki kloroplast alt bölmesi farklı lipit ve protein bileşimlerini korur, ancak iki bölme arasındaki düzenlenmiş lipit ve protein değişimiönerilmiştir 2,4,17,18,19. Aslında, son zamanlarda kloroplastlar ve sitosol19 arasındaki nötr lipitlerin kaçakçılığı için ilginç bir hemifüzyon modeli önerilmiştir. Plastoglobüllerin ve tilakoidlerin fiziksel sürekliliği nedeniyle, sağlıklı yaprak dokusu ile izolasyon yöntemi, daha sonra plastoglobülleri tilakoidlerden ayırmak için sonikleştirilen peletlenmiş ham tilakoid preparatının toplanmasıyla başlar, bu da sitozolik lipit damlacıklarını izole etmek için kullanılan yöntemlerin aksinedir20 . Bir sakkaroz yastığı üzerindeki ultrasantrifüjleme daha sonra düşük yoğunluklu plastoglobülleri sakkaroz boyunca yüzdürür ve onları tilakoidlerden, çekirdeklerden ve diğer yüksek yoğunluklu malzemelerden etkili bir şekilde ayırır. Buna karşılık, siyanobakterilerdeki plastoglobüllerin yanı sıra kurutulmuş yaprak dokusundakiler, serbest yüzen bir formda in vivo olarak açıkça bulunur. Bu nedenle, izolasyonları doğrudan bir sakkaroz gradyanı üzerinde yüzmeyi içerir. Bu makale, sağlıklı yaprak dokusundan izolasyon yöntemini göstermektedir ve ayrıca plastoglobülleri kurutulmuş yaprak dokusundan veya siyanobakteriyel kültürlerden izole etmek için kullanılabilecek iki varyasyonu göstererek, plastoglobüllerin çalışılabileceği fizyolojik genişliği ve evrimsel bağlamı büyük ölçüde genişletmektedir.
İzole plastoglobüller daha sonra moleküler özellikleri araştırmak için herhangi bir sayıda aşağı akış analizi için kullanılabilir. A. thaliana yaprak dokusundan izole plastoglobülleri, farklı çevresel koşullar veya genotipler altında kapsamlı proteomik ve lipidomik analiz için kullandık ve stres 2,4,21,22’ye adaptasyonda protein ve lipit bileşiminin seçici modifikasyonunu gösterdik. Ek olarak, izole plastoglobüllerle ilişkili trans-fosforilasyon aktivitesini gösteren in vitro kinaz testleri22, protein bileşenlerinin oligomerik durumları doğal jel elektroforezi 21 kullanılarak araştırıldı ve proteaz tıraş testleri23 yapıldı.
Bu yöntemin birincil yararı, prosedürün göreceli hızıdır. Deneyimlerimize göre, aşağıda özetlenen protokoller yaklaşık 4 saat içinde tamamen tamamlanabilir. Plastoglobülleri yaprak dokusundan izole etmek için alternatif bir yöntem tanımlanmıştır, bu da diğer kloroplast alt bölmelerinin eşzamanlı izolasyonuna izin verir24. Bu alternatif yöntem, diğer kloroplast alt bölmeleriyle kantitatif karşılaştırma gerektiğinde veya istendiğinde bazı açık avantajlar sunar. Bununla birlikte, bu alternatif yöntem aynı zamanda daha sıkıcıdır ve karşılaştırılabilir miktarlarda yaprak dokusundan izole plastoglobüllerin önemli ölçüde daha düşük verimini sağlayacaktır. Plastoglobüllerin odaklanmış bir çalışması amaçlandığında, burada özetlenen metodoloji en uygun seçimdir. Bununla birlikte, numune hazırlama sırasında toplam yaprak ve ham tilakoid alikotlar toplanabilir ve daha sonraki karşılaştırmalar için referans numunelere sahip olmak için bunu yapmanız şiddetle tavsiye edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Malzemedeki fizyolojik / biyokimyasal değişiklikleri en aza indirmek ve plastoglobüllerin zengin bir bileşeni olan bazı foto-ve termo-kararsız prenil-lipid pigmentlerini korumak için, izolasyonun 4 ° C’de yapılması ve ışıktan korunması kritik öneme sahiptir. Yukarıda belirtildiği gibi, ilk adımlar soğuk odada yeşil yayan bir ampul kullanılarak bir güvenlik lambasının altında gerçekleştirilir. Laboratuvarda gerçekleştirilen sonraki adımlar soluk ışıklar altındadır ve buz veya soğutulmu?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lundquist laboratuvar grubundaki araştırmalar, NSF (MCB-2034631) ve USDA’dan (MICL08607) P.K.L.’ye verilen hibelerle desteklenmektedir. Yazarlar, siyanobakteriyel plastoglobül izolasyon yönteminin geliştirilmesindeki desteği için Dr. Carrie Hiser’e (MSU) teşekkür eder.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K. Plastoglobule proteome. Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C., Jarvis, R. P. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
