جمع ديناميكي في الوقت الحقيقي للسائل خارج الخلية الحصين من الفئران الواعية باستخدام نظام غسيل الكلى
Summary
يوفر البروتوكول هنا عينة ديناميكية مفصلة في الوقت الفعلي للسائل خارج الخلية من الحصين للفئران المستيقظة باستخدام نظام غسيل الكلى الدقيق.
Abstract
ترتبط مجموعة متنوعة من أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) بالتغيرات في تكوين السائل خارج الخلية الحصين (HECF). ومع ذلك ، فإن صعوبة الحصول على HECF في الوقت الفعلي من الفئران الواعية قد قيدت منذ فترة طويلة تقييم تطور مرض الجهاز العصبي المركزي وفعالية العلاج بالطب العرقي. من المشجع أنه يمكن استخدام تقنية غسيل الكلى المجهري في الدماغ لأخذ العينات المستمرة مع مزايا الملاحظة الديناميكية والتحليل الكمي وحجم أخذ العينات الصغير. وهذا يسمح بمراقبة التغيرات في محتوى السائل خارج الخلية للمركبات من الأعشاب التقليدية ومستقلباتها في دماغ الحيوانات الحية. وبالتالي كان الهدف من هذه الدراسة هو زرع مسبار غسيل الكلى الدقيق للسائل النخاعي بدقة في منطقة الحصين لفئران Sprague Dawley (SD) بجهاز تجسيمي ثلاثي الأبعاد للدماغ ، مما يؤدي إلى قطع الأوزان الجزيئية التي تزيد عن 20 كيلو دالتون. ثم تم الحصول على HECF عالي الجودة من الفئران الواعية باستخدام نظام التحكم في أخذ عينات غسيل الكلى مع معدل أخذ عينات قابل للتعديل من 2.87 nL / min – 2.98 مل / دقيقة. في الختام ، يوفر بروتوكولنا طريقة فعالة وسريعة وديناميكية للحصول على HECF في الفئران المستيقظة بمساعدة تقنية غسيل الكلى الدقيقة ، والتي توفر لنا إمكانيات غير محدودة لمواصلة استكشاف التسبب في الأمراض المرتبطة بالجهاز العصبي المركزي وتقييم فعالية الدواء.
Introduction
أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) ذات الأمراض المرتفعة ، مثل الأمراض التنكسية العصبية ، وإصابات الدماغ الرضحية ، وإصابات الدماغ الناجمة عن نقص الأكسجة على ارتفاعات عالية ، والسكتة الدماغية الإقفارية ، هي أسباب حاسمة لتزايد معدل الوفيات في جميع أنحاء العالم1،2،3. تساهم المراقبة في الوقت الفعلي للسيتوكينات وتغيرات البروتين في مناطق معينة من الدماغ في الدقة التشخيصية لأمراض الجهاز العصبي المركزي ودراسات الحرائك الدوائية للدماغ بعد الدواء. يستخدم البحث العلمي التقليدي تجانس أنسجة المخ أو مجموعة يدوية من سائل الدماغ الخلالي الحيواني للكشف عن مواد معينة ولدراسات الحرائك الدوائية. ومع ذلك ، فإن هذا له بعض أوجه القصور ، مثل حجم العينة المحدود ، وعدم القدرة على مراقبة التغييرات في المؤشرات ديناميكيا ، وجودة أخذ العيناتغير المتكافئة 4،5،6. يحمي السائل الدماغي الشوكي ، وهو سائل خلالي ، الدماغ والحبل الشوكي من التلف الميكانيكي. يختلف تكوينه عن تكوين المصل بسبب وجود حاجز الدم في الدماغ (BBB)7. التحليل المباشر لعينات السائل النخاعي هو أكثر ملاءمة للكشف عن آلية آفات الجهاز العصبي المركزي واكتشاف المخدرات. حتما ، عينات السائل النخاعي ، التي يتم الحصول عليها يدويا مباشرة من الصهريج العظيم والبطينين الدماغيين من خلال حقنة ، لها عيوب تلوث الدم ، وفرصة عشوائية لجمع العينات ، وعدم اليقين في الكمية ، وتقريبا لا توجد إمكانية استرجاع متعددة 8,9. والجدير بالذكر أن طرق أخذ عينات سوائل الدماغ الخلالية التقليدية لا يمكنها الحصول على عينات من مناطق الدماغ التالفة ، مما يعيق استكشاف التسبب في أمراض الجهاز العصبي المركزي في مناطق معينة من الدماغ وتقييم فعالية علاجات الطب العرقي المستهدفة 9,10.
غسيل الكلى الدقيق في الدماغ هو تقنية لأخذ عينات من سائل الدماغ الخلالي في الحيوانات المستيقظة11. يقلد نظام غسيل الكلى الدقيق نفاذية الأوعية الدموية بمساعدة مسبار مزروع في الدماغ. مسبار غسيل الكلى الصغير مسلح بغشاء شبه نافذ ويتم زرعه في مناطق معينة من الدماغ. بعد التروية باستخدام السائل النخاعي الاصطناعي متساوي التوتر (ACSF) ، يمكن جمع سائل الدماغ الخلالي المحلل بشكل إيجابي مع فوائد أحجام العينات الصغيرة ، وأخذ العينات المستمر ، والملاحظة الديناميكية12,13. من حيث الموقع ، يمكن زرع مجسات غسيل الكلى الدقيقة في الدماغ بشكل انتقائي في هياكل الدماغ أو صهاريج الجمجمة ذات الأهمية14. تشير ملاحظة المستويات غير الطبيعية لمادة داخلية في السائل خارج الخلية الحصين (HECF) إلى حدوث أمراض الجهاز العصبي المركزي أو التسبب في المرض. أظهرت العديد من الدراسات أن المؤشرات الحيوية لأمراض الجهاز العصبي المركزي ، مثل الأحماض الأمينية D في الفصام ، وبروتينات β-amyloid و tau في مرض الزهايمر ، وسلاسل ضوء الخيوط العصبية في إصابات الدماغ الرضحية ، و ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1s في اعتلال الدماغ نقص تروية نقص التأكسج ، يمكن تحليلها في السائل الدماغيالنخاعي 15،16،17 . يمكن استخدام طريقة التحليل الكيميائي القائمة على تقنية أخذ عينات غسيل الكلى في الدماغ لمراقبة التغيرات الديناميكية للمركبات الخارجية مثل المكونات النشطة للطب العرقي ، والتي تنتشر وتتوزع في مناطق معينة من الدماغ14.
تقدم هذه المقالة العملية المحددة لاكتساب HECF الديناميكي في الفئران المستيقظة وتقيس ضغطها التناضحي لضمان جودة العينة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا يزال التسبب في أمراض الجهاز العصبي المركزي غير مفهوم تماما ، مما يعيق تطوير علاجات وأدوية جديدة. أظهرت الدراسات أن معظم أمراض الجهاز العصبي المركزي ترتبط ارتباطا وثيقا بآفات الحصين20،21،22. يمكن أن تستهدف تقنية غسيل الكلى المجهري المقتر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82104533) ، وقسم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (2021YJ0175) ، ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2020M683273). يود المؤلفون أن يشكروا السيد Yuncheng Hong، كبير مهندسي المعدات في Tri-Angels D&H Trading Pte. المحدودة (سنغافورة) لتقديم الخدمات التقنية لتقنية غسيل الكلى الدقيق.
Materials
| Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
| Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
| Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
| Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
| Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Osmometer | Löser | OM 807 | |
| Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
| Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. O., Geschwind, M. D. Clinical neurology and epidemiology of the major neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 033118 (2018).
- Salehi, A., Zhang, J. H., Obenaus, A. Response of the cerebral vasculature following traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2320-2339 (2017).
- Kurtzman, R. A. e. m. 3., Caruso, J. L. High-altitude illness death investigation. Academic Forensic Pathology. 8 (1), 83-97 (2018).
- Matsumoto, T., et al. Pharmacokinetic study of Ninjin’yoeito: Absorption and brain distribution of Ninjin’yoeito ingredients in mice. Journal of Ethnopharmacology. 279, 114332 (2021).
- Mahat, M. Y., et al. An improved method of transcutaneous cisterna magna puncture for cerebrospinal fluid sampling in rats. Journal of Neuroscience Methods. 211 (2), 272-279 (2012).
- Ceaglio, N., et al. High performance collection of cerebrospinal fluid in rats: evaluation of erythropoietin penetration after osmotic opening of the blood-brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 219 (1), 70-75 (2013).
- Bothwell, S. W., Janigro, D., Patabendige, A. Cerebrospinal fluid dynamics and intracranial pressure elevation in neurological diseases. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 9 (2019).
- Barthel, L., et al. A step-by-step guide for microsurgical collection of uncontaminated cerebrospinal fluid from rat cisterna magna. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109085 (2021).
- Zhao, Y., Yang, Y., Wang, D. X., Wang, J., Gao, W. Y. Cerebrospinal fluid amino acid metabolite signatures of diabetic cognitive dysfunction based on targeted mass spectrometry. Journal of Alzheimer’s Disease. 86 (4), 1655-1665 (2022).
- Lim, N. K., et al. An improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice. Journal of Visualized Experiments. (133), e56774 (2018).
- Hendrickx, S., et al. A sensitive capillary LC-UV method for the simultaneous analysis of olanzapine, chlorpromazine and their FMO-mediated N-oxidation products in brain microdialysates. Talanta. 162, 268-277 (2017).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
- Hammarlund-Udenaes, M. Microdialysis as an important technique in systems pharmacology-a historical and methodological review. The AAPS Journal. 19 (5), 1294-1303 (2017).
- Anderzhanova, E., Wotjak, C. T. Brain microdialysis and its applications in experimental neurochemistry. Cell and Tissue Research. 354 (1), 27-39 (2013).
- Mohammadi, A., Rashidi, E., Amooeian, V. G. Brain, blood, cerebrospinal fluid, and serum biomarkers in schizophrenia. Psychiatry Research. 265, 25-38 (2018).
- Lashley, T., et al. Molecular biomarkers of Alzheimer’s disease: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), 031781 (2018).
- Kawata, K., Tierney, R., Langford, D. Blood and cerebrospinal fluid biomarkers. Handbook of Clinical Neurology. 158, 217-233 (2018).
- Zhao, Q. P., et al. Protective effects of dehydrocostuslactone on rat hippocampal slice injury induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation. International Journal of Molecular Medicine. 42 (2), 1190-1198 (2018).
- Wang, X. B. . Protective effects of dehydrocostuslactone on oxygen-glucose deprivation injury in rat hippocampal slices. , (2017).
- Coimbra-Costa, D., Alva, N., Duran, M., Carbonell, T., Rama, R. Oxidative stress and apoptosis after acute respiratory hypoxia and reoxygenation in rat brain. Redox Biology. 12, 216-225 (2017).
- Liu, H. Y., Chou, K. H., Chen, W. T. Migraine and the Hippocampus. Current Pain and Headache Reports. 22 (2), 13 (2018).
- Toda, T., Parylak, S. L., Linker, S. B., Gage, F. H. The role of adult hippocampal neurogenesis in brain health and disease. Molecular Psychiatry. 24 (1), 67-87 (2019).
- Wang, P., Lo Cascio, F., Gao, J., Kayed, R., Huang, X. F., F, X. Binding and neurotoxicity mitigation of toxic tau oligomers by synthetic heparin like oligosaccharides. Chemical Communications. 54 (72), 10120-10123 (2018).
- Han, J. Y., Li, Q., Ma, Z. Z., Fan, J. Y. Effects and mechanisms of compound Chinese medicine and major ingredients on microcirculatory dysfunction and organ injury induced by ischemia/reperfusion. Pharmacology & Therapeutics. 177, 146-173 (2017).
- Peng, T. M., et al. Anti-inflammatory effects of traditional Chinese medicines on preclinical in vivo models of brain ischemia-reperfusion-injury: Prospects for neuroprotective drug discovery and therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 204 (2019).
- König, M., Thinnes, A., Klein, J. Microdialysis and its use in behavioural studies: Focus on acetylcholine. Journal of Neuroscience Methods. 300, 206-215 (2018).
- Liu, M. Z., Wang, P., Yu, X. M., Dong, G. C., Yue, J. Intracerebral microdialysis coupled to LC-MS/MS for the determination tramadol and its major pharmacologically active metabolite O-desmethyltramadol in rat brain microdialysates. Drug Testing and Analysis. 9 (8), 1243-1250 (2017).
- de Lima Oliveira, M., et al. Cerebral microdialysis in traumatic brain injury and subarachnoid hemorrhage: state of the art. Neurocritical Care. 21 (1), 152-162 (2014).
- Amiridze, N., Dang, Y., Brown, O. R. Hydroxyl radicals detected via brain microdialysis in rats breathing air and during hyperbaric oxygen convulsions. Redox Report. 4 (4), 165-170 (1999).
- Chang, H. Y., Morrow, K., Bonacquisti, E., Zhang, W., Shah, D. K. Antibody pharmacokinetics in rat brain determined using microdialysis. MABS. 10 (6), 843-853 (2018).
- Wan, H. Y., et al. Pharmacokinetics of seven major active components of Mahuang decoction in rat blood and brain by LC-MS/MS coupled to microdialysis sampling. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 393 (8), 1559-1571 (2020).
- Zheng, H. Z., et al. Pharmacokinetic analysis of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on blood and brain tissue in rats with normal and cerebral ischemia-reperfusion Injury by microdialysis with HPLC-MS/MS. Drug Design Development and Therapy. 14, 2877-2888 (2020).
- Bongaerts, J., et al. Sensitive targeted methods for brain metabolomic studies in microdialysis samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 161, 192-205 (2018).
- Zhang, Y. Q., Jiang, N., Yetisen, A. K. Brain neurochemical monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 189, 113351 (2021).
