Summary
Detta protokoll beskriver steg-för-steg autofluorescensavbildning och utvärdering av fykobiliproteinförändringar i röda alger baserat på spektralanalys. Detta är en etikettfri och icke-destruktiv metod för att utvärdera cellulär anpassning till extrema livsmiljöer, när endast knappa material är tillgängligt och celler växer långsamt, eller inte alls, under laboratorieförhållanden.
Abstract
Röda alger (Rhodophyta) innehåller phycobiliproteiner och koloniserar livsmiljöer med svagt ljus, men vissa (t.ex. vissa Chroothece-arter ) kan också utvecklas i fullt solsken. De flesta rodofyter är röda, men vissa kan verka blåaktiga, beroende på andelen blå och röda biliproteiner (phycocyanin och phycoerythrin). Olika fykobiliproteiner kan fånga ljus vid olika våglängder och överföra det till klorofyll a, vilket möjliggör fotosyntes under mycket olika ljusförhållanden. Dessa pigment svarar på livsmiljöförändringar i ljus, och deras autofluorescens kan hjälpa till att studera biologiska processer. Med Chroothece mobilis som modellorganism och spektral lambdaskanningsmetod i ett konfokalmikroskop studerades anpassningen av fotosyntetiska pigment till olika monokromatiska ljus på cellulär nivå för att gissa artens optimala tillväxtförhållanden. Resultaten visade att även när den studerade stammen isolerades från en grotta, anpassade den sig till både svaga och medelhöga ljusintensiteter. Den presenterade metoden är särskilt användbar för att studera fotosyntetiska organismer som inte växer eller växer mycket långsamt under laboratorieförhållanden, vilket vanligtvis är fallet för dem som lever i extrema livsmiljöer.
Introduction
Röda alger, som släktet Chroothece, kan växa i extrema livsmiljöer, där de ofta måste hantera markanta miljöförändringar1. Översvämningar och torka är vanliga i halvtorra regioner där detta släkte kan hittas, och vissa arter har rapporterats i bäckar, klippor, grottor eller till och med termiskt vatten2. Men för det mesta förvisar biologiska variabler, såsom konkurrens eller bete, arter till icke-optimala förhållanden för deras tillväxt. Eftersom dessa organismer ofta är svåra att odla och antingen inte växer eller växer mycket långsamt under laboratorieförhållanden, är en stor begränsning den tillgängliga provstorleken. Därför är det mycket viktigt att följa icke-destruktiva metoder eller metoder som involverar minimal provmanipulation 3,4.
De fysiologiska färdigheter som behövs för att överleva i dessa hårda miljöer kan övervakas genom att följa förändringar i deras fotosyntetiska system. Metaboliska mekanismer, fotosyntetisk effektivitet och känslighet för ljus- eller odlingsförhållanden kan avslöjas av pigmentfluorescensemissionsprofiler på grund av exakta förändringar i deras energiöverföring eller fångst 5,6,7,8.
Autofluorescens av cellulära föreningar kan användas som en markör för cytodiagnos eller som en naturlig indikator på cellulärt tillstånd eller metabolism som svar på externa och interna signaler genom förändringar i emission9. Det kan också användas för att taxonomiskt diskriminera olika grupper av fotosyntetiska organismer10. Beroende på den fylogenetiska positionen för fototrofa mikroorganismer kan man hitta olika fluorescensegenskaper in vivo. Därför har en taxonomisk identifiering baserad på in vivo-egenskaperna hos fototrofisk fluorescens (inklusive fluorescensabsorption och emissionsspektra) gjorts vid flera tillfällen11,12. På grund av mångfalden i accessoriska pigment bland fytoplanktontaxa kan skillnader i våglängderna vid vilka klorofyll a (Chl a) fluorescens stimuleras, eller skillnader i emissionsspektra, användas för att härleda taxonomi13. In vivo fluorescensexcitation och emissionsspektra för dessa prover förlitar sig inte bara på algens fyla utan också på fotosystemanpassning14. Effektiviteten av energiöverföring till Chl a, eller förhållandet mellan Chl a och tillbehörspigment, och cellulärt pigmentinnehåll är känsliga för tillväxtförhållanden5.
Röda alger, särskilt Chroothece, har flera accessoriska fluorescerande pigment-fykobiliproteiner och karotenoider; Det förra koncentreras i phycobilisomes bundna till tylakoiderna av kloroplaster. Phycobiliproteins (phycocyanin, phycoerytrin och allophycocyanin) kan fånga ljus vid olika våglängder och överföra det till Chl a, vilket möjliggör fotosyntes i mycket olika ljus- och odlingsförhållanden15. Till exempel kan Chroothece-arter växa inuti grottor eller nästan dyka upp i lätt salthaltiga kalkhaltiga strömmar2.
Monokromatiska ljus påverkar tillväxten och pigmentsammansättningen hos fotosyntetiska organismer och har studerats för att förhindra eller kontrollera tillväxten av fotosyntetiska organismer i grottor. Mulec et al. visade att röd berikad belysning främjar tillväxten av cyanobakterier, alger och växter16. Tidigare studier har också rapporterat att grönt ljus påverkar pigmentsammansättningen av cyanobakterier17, medan andra har visat att grönt ljus förhindrar tillväxten av de flesta fotosyntetiska organismer och vissa cyanobakterier uppvisar en minskning av tylakoider och svagare genomsnittlig fluorescensintensitet18.
För att förstå Chrootheces förmåga som modellorganism att övervinna svåra förhållanden har odlade celler utsatts för ökande ljusintensiteter och monokromatiskt ljus (grönt eller rött)15, för att se hur det klarar de svaga förhållandena i grottor (där rött ljus dominerar). Protokollet som presenteras här återger effekten av de ovan nämnda variablerna på Chrootheces fykobiliproteiner på cellulär nivå med hjälp av sin egen autofluorescens.
Numera används fluorescens ofta som ett verktyg för att studera de fysiologiska svaren hos kärlväxter, mikroalger, makroalger och cyanobakterier13,14,16. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi är ett utmärkt verktyg för in vivo-studier för att utvärdera fotosyntetiska provers fysiologi på encellsnivå 10,17,18,19,20, genom att undvika problem i samband med den låga tillväxthastigheten i laboratoriet och svårigheterna med att erhålla tillräckligt med biomassa för tillhörande extraktion och biokemiska metoder8 . När cellerna har behandlats under olika odlingsförhållanden i 2 veckor kan lambdaskanningsprofilen mätas in vivo. Även om det finns flera publikationer där olika våglängder av excitation genom konfokal avbildning har använts 3,4,10,17, kan de flesta fykobiliproteiner och Chl a detekteras med hjälp av en 561 nm våglängds excitationslinje, och den detekterade emissionen sträcker sig från 570 till 760 nm våglängd. Dessa kriterier har baserats på en analys som tidigare utförts 10 med kommersiella rena pigment (tabell 1) genom konfokal avbildning och de erhållna resultaten i olika algarter20,21,22.
| Pigment | λFLmax (Nm) | λ exc (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11.2 ± 0.2 | 1.8 ± 0.05 | 2.0 ± 0.08 | 12.2 ± 0.7 | 6.0 ± 0.3 | 4.2 ± 0.16 | 80,7 ± 1,5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 11,1 ± 0,04 | 42,2 ± 0,3 | 100.0 ± 0 | 90,0 ± 0,3 | 99,2 ± 0,08 | - |
| 652.1-668.6 | - | - | 1,5 ± 0,01 | 3.7 ± 0.04 | 26.7 ± 0.5 | 8.7 ± 0.16 | 11.1 ± 0.16 | 11,3 ± 0,2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1.0 ± 0.01 | 0,6 ± 0,004 | 0,7 ± 0,008 | 2.0 ± 0.08 | 2.0 ± 0.04 | 3.3 ± 0.16 | 33,6 ± 0,9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15.1 ± 1.5 | 9.6 ± 0.98 | 1.0 ± 0.04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.1 ± 0.5 | 23.2 ± 3.5 | 91,4 ± 2,3 |
Tabell 1: Den rena pigmentinformation som används för att utföra lambdaskanningsanalysen. Denna tabell visar emissionstoppar och bogar/fluorescensbandsmaxima för olika fluorokromer/pigment med konfokal avbildningsspektrofotometri för alla excitationsvåglängder och procentandelen ljusemission av pigment/fluorokromer. Värdena beräknades med formeln: = MFI * 100/255. Varje värde är medelvärdet ± SE (medelvärde ± standardfel från medelvärdet). Rena pigment användes för kalibrering av det konfokala skanningslasermikroskopet enligt följande: 1,2,10. Klorofyll a erhölls från Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) från Porphyra tenera och C-phycocyanin (C-PE) från Spirulina sp. Alla arter löstes i filtrerat destillerat vatten. Allophycocyanin-XL (APC-XL) erhölls från Mastigocladus laminosus, som löstes i ammoniumsulfat (60%) och kaliumfosfat (pH = 7) för att uppnå en koncentration av 38 mM. Skanningarna utfördes med 400 μL av varje pigmentlösning (koncentration av 1 mg / ml) med användning av en 8-väl täckt glasbottenkammare.
Studien av en enda excitationsvåglängd är en ganska användbar första approximation. I detta fall är det emellertid nödvändigt att belysa det relativa bidraget från de olika komplexen i fluorescenssignalen, vilket rekommenderas att utföra ett fluorescensförhållande eller spektrumanalys vid flera våglängder, bland andra metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Algarten Chroothece mobilis användes för den aktuella studien. Arten erhölls från Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29 kultursamling. En översikt över protokollet visas i figur 1.
Figur 1: Översikt över studien. Chroothece mobilis inkuberas under extrema livsmiljöförhållanden, såsom olika monokromatiska ljus, i 2 veckor. Effekten på Chrootheces fysiologi utvärderas genom autofluorescens av proteinerna i fykobilisom- och fotosystem med hjälp av ett konfokalt laserskanningsmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1. Beredning av prov
- Bered ympningen av Chroothece mobilis från agarkulturen i samlingen genom att överföra den till SWES flytande medium (tabell 2).
OBS: SWES "Seewasser + Erddekokt + Salze" = havsvatten medium23. - Behåll alla kulturer i 2 veckor med en ljus/mörk fotoperiod på 16:8 vid 20 °C under förhållanden med låg vit ljusintensitet (LL: 80 μM/m2/s) och utan skakningar tills önskad celldensitet erhålls (se steg 1.3).
OBS: Tillväxtljusförhållandena är 80 μM / m2 / s ljusintensitet (aktiv fotosyntetisk strålning, PAR). Dessa förhållanden används som svagt ljus (kontroll). SWES-mediets sammansättning anges i tabell 2. - Utför inokuleringar för de olika experimenten i exponentiell odlingsfas med en celldensitet på 5 x 103 celler / ml i en 24-brunnsplatta, med 1 ml per brunn.
OBS: Utför cellräkning med en Neubauer-kammare24 och späd kulturen med SWES vid behov.
| SWES medium sammansättning | |
| Komponent | Koncentration |
| KNÖ3 | 1,98 mM |
| K2HPO4 | 115 μM |
| MgSO4 | 81 μM |
| ZnSO4, 7H2O | 17 nM |
| MnSO4, 7H2O | 45 Nm |
| H3BO3, 4H2O | 3,1 mM |
| Ko(NEJ3)2 | 17 mM |
| Na2MoO4,6H2O | 21 nM |
| CuSO4, 2H2O | 0,1 nM |
| FeSO4,5H2O | 13 μM |
| EDTA, 7H2O | 11 μM |
| Vit B12 | 5 μg |
| Jord extrakt | 30 ml |
| Filtrerat flodvatten | 455 ml |
Tabell 2: SWES medium sammansättning.
2. Reproduktion av extrema alghabitatförhållanden: grön och röd monokromatisk ljuseffekt
- Tillsätt 1 ml av cellkulturen från stamkulturen beredd med ovannämnda celldensitet (steg 1.2) för att inokulera varje brunn på en 24-brunnsplatta.
- Håll cellkulturen täckt i 2 veckor för att reproducera den monokromatiska ljuseffekten.
- Använd det gröna filtret som tillåter grönt ljus att passera från 470 till 570 nm med en topp vid 506 nm våglängd (enligt tillverkarens specifikationer, se materialförteckning) och exponera det för kulturen25.
- Använd det röda filtret som tillåter rött ljus mellan 590 och 720 nm och toppar vid 678 nm (enligt tillverkarens specifikationer; se materialförteckning) för att exponera det för kulturen25.
OBS: Tillståndet låg vit ljusintensitet (LL: 80 μM / m2 / s; se materialtabell) används som ljusintensitetskontroll för att jämföra de erhållna effekterna. De använda ljusintensitetsenheterna är mikromol per sekund och kvadratmeter (μmol m-2 s-1) eller fotosyntetisk fotonflödestäthet (PPFD).
3. Autofluorescensavbildning
OBS: Installationen av bildhanteringsprogrammet (se materialförteckningen) illustreras i figur 2.
- Slå på alla komponenter i det inverterade konfokala laserskanningsmikroskopet (CLSM; se materialförteckning), inklusive lasern.
- Montera cellerna från varje experimentell brunn på 24-brunnsplattan i SWES odlingsmedium till en 35 mm glasbottenskål (se Materialtabell) för avbildning.
- Välj 63x/1,30 NA glycerol nedsänkningsmål och placera glycerol över linsen (se Materialförteckning).
- Placera brunnplattan på mikroskopsteget och se till att provet inte rör sig under bildförvärv.
- Centrera provet i ljusbanan och fokusera på mitten av cellen genom att välja planet med den högsta fluorescensintensiteten.
- Öppna programvaran för bildinsamling och välj xyλ i listrutan i förvärvsläge26.
- Välj laserns excitationslinje till 561 nm DPSS, 8 bitar dynamiskt omfång och 1024 x 1024 pixlar.
OBS: Se till att konfokalmikroskopet har en 561 nm DPSS-laser eller en vit ljuslaser (WLL). - Samla in fluorescensemissionsspektra i bandbredden 10 nm och lambdastegstorleken 4 nm inom intervallet 570-760 nm.
- Ställ in nålhålet på 1 Airy-enhet och kör lambdaskanningsförvärvet.
- Upprepa denna process så många gånger som möjligt i olika synfält för att samla in en acceptabel mängd data för statistisk analys (vanligtvis en standardavvikelse lägre än 10%22).
- Upprepa det sista steget under olika förhållanden (under rött och grönt ljus) och spara data.
Använd samma inhämtningsinställningar för de olika urvalen och förhållandena för att jämföra och genomföra den statistiska analysen.
Bild 2: Programvaruinstallation. Användargränssnitt för bildhanteringsprogramvara för att ställa in lambdaskanningsparametrarna. (A) Från vänster till höger, för att välja förvärvsläge xyλ från listrutan, som motsvarar steg 3.6 i protokollet, och för att välja rätt typ av nedsänkningslins, motsvarande steg 3.3 i protokollet. Se till att ta bort alla filter från ljusbanan i steg 3.9. (B) Panelen för inställning av lambdascanningsparametrarna motsvarar steg 3.8 i protokollet. (C) Kör lambdaskanningen i steg 3.10. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Parametrar för att utvärdera Chrootheces fysiologi
- När lambdaskanningen har förvärvats klickar du på kvantifieringsfönstret högst upp i programvaran (som visas i figur 3) för att utvärdera de uppsamlade fluorescensemissionsspektra. Gå till fönstret Öppna projekt och välj en xyλ-fil (bild 3).
- Välj Stack profile analysis i bildhanteringsprogrammet.
- Definiera en intresseregion (ROI) på 4 μm2 i mitten av en cell för att analysera den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI). Exportera data i CSV-format.
OBS: Det är viktigt att undvika förekomsten av svarta pixlar (för att säkerställa att de valda pixlarna innehåller positiva värden) och alltid behålla samma storlek ROI. - Upprepa denna process med olika celler under olika förhållanden för att producera tillräckligt med data för att utföra statistisk analys.
- Öppna CSV-filerna för att välja de olika fluorescensemissionstopparna från fykobiliproteinerna och klorofyllerna för alla uppmätta ROI.
- Välj fluorescensdata för fykoerytrin-fykocyanobilin (PE-PCB; 620 nm), C-phycocyanin (CPC; 648 nm), allophycocyanin (APC; 660 nm) respektive klorofyll a (Chl a; 680 nm) i csv-filen.
- Skapa en ny tabell med alla maximala fluorescensvärden som erhållits från varje phycobiliprotein och klorofylltopp och plotta data i ett diagram.
- Utför statistisk analys.
- Analysera om de erhållna uppgifterna uppfyller normalitet och homoscedasticitet27.
- Fortsätt till t-testanalysen27,28 om det första villkoret är sant. Om inte, kör ett Mann-Whitney U-test29.
- Tänk på skillnaderna signifikanta vid p-värden <0,05.
Figur 3: Utvärdering av Chrootheces autofluorescens. För att utföra autofluorescensanalysen, se till att välja kvantifieringsfönstret och en xyλ-fil i det öppna projektfönstret (steg 4.1); välj Stack Profile Visualization (steg 4.2); välj en ROI på 4 μm2 i mitten av en cell och klicka på rapportknappen för att exportera lambdaskanningsdata i CSV-format (steg 4.3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Klorofyll a absorberar i allmänhet blå och röda våglängder av synligt ljus, medan fykobiliproteiner använder gröna, gula och orange våglängder7. Autofluorescensen hos dessa pigment gör det första sättet att studera fykobiliproteiner och klorofyllbeteende under experimentella och fältförhållanden möjligt.
Genom att jämföra erhållna data och plotta på olika grafer kan signifikanta förändringar i genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) särskiljas (figur 4). En bakomliggande statistisk studie av de olika emissionstopparna som erhållits i lambdascanningsprofilerna (620, 648, 660 och 680 nm) visade signifikanta skillnader (statistisk signifikans: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).
MFI för PE-PCB minskade signifikant när cellerna utsattes för grönt monokromatiskt ljus (GL), men ingen skillnad jämfört med kontrollen observerades i rött ljus (RL) (figur 4A). GL hade emellertid motsatt effekt på APC och Chl a (figur 4B, C), där MFI ökade signifikant på grund av anpassningen av antennkomplex, bland annat på grund av antingen en ökad kvantitet eller förbättrad anslutning av antennkomplexen. RL gav en icke-signifikant ökning av både APC och CHL a fluorescens 17,24,25,26.
Figur 4: Effekter på fluorescensen hos Chroothece phycobiliproteins och klorofyll a under monokromatisk ljusbehandling. (A–C) Den fluorescensemissionsintensitet som erhölls vid 561 nm excitationsvåglängden i lambdaskanningen och efter att ha analyserat data relaterade till olika fykobiliproteiner (A: PE-PCB; B: APC) och klorofyll (C: Chl a). Rutorna innehåller de plottade median-, minimi- och maximivärdena för fluorescensemissionsintensiteten. Gröna lådor: grönt monokromatiskt ljusförhållande (GL); röda rutor: rött monokromatiskt ljus (RL); och blå rutor: svagt ljus (LL, kontroll). Statistisk signifikans: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vissa encelliga eller koloniala röda alger, såsom Chroothece, växer långsamt in vitro, men innehåller flera autofluorescerande föreningar som kan analyseras genom spektralanalys under ett konfokalmikroskop, där skillnader i pigmentemissionstoppar kan detekteras. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi har gjort det möjligt för oss att genomföra in vivo-studier för att utvärdera anpassningen eller acklimatiseringen av fotosyntetiska organismer 8,10,17,18,19,20. De flesta andra tekniker, såsom proteinanalys, kräver stora mängder prover, är destruktiva eller är mycket dyrare.
Våglängden på 561 nm valdes här eftersom den är mer selektiv för fykobiliproteiner (baserat på en tidigare rapport23); Det bekräftade resultaten av en tidigare studie om GL-effekterna på cyanobakterier med tre olika excitationsvåglängder (351, 488 och 543 nm). För att få tillförlitliga data är det viktigt att förvärva alla data under samma mikroskopförhållanden.
Detta protokoll är ett enkelt första tillvägagångssätt för att studera beteendet hos Chroothece-celler under olika ljusförhållanden, samtidigt som det också ger möjlighet att erhålla signifikanta skillnader i sammansättningen av fykobiliprotein eller klorofyller som har behandlats under distinkta monokromatiska ljusförhållanden, tack vare den efterutförda analysen. Detta hjälper till att utvärdera hur röda algceller svarar på förändringar i livsmiljöförhållanden och lära sig deras anpassningsförmåga till extrema livsmiljöer.
Algceller är mycket rika på autofluorescerande pigment (klorofyll, fykobiliproteiner, karotenoider), med fluorescens som spänner över ett brett spektrum av våglängder. Detta faktum kan komplicera CLSM-bildanalys; fluorescens lifetime imaging (FLIM), spektral blandning och excitation av den vita lasern kan dock hjälpa till att separera signaler30,31. En bra korrelation finns vanligtvis mellan det fysiologiska tillståndet och fotosyntetisk pigmentprestanda i mikroalger3.
Icke desto mindre är destruktiva tekniker obligatoriska för att bedöma förändringar i det relativa bidraget från olika fluorescenskomplex i fluorescenssignalen, eller för att utföra ett fluorescensförhållande och/eller spektrumanalys vid flera excitationsvåglängder.
Att använda denna metod är särskilt viktigt när det finns ont om material och/eller celler antingen inte växer eller växer mycket långsamt under laboratorieförhållanden. Spektralteknik kan erbjuda framsteg som lasrar med vitt ljus (för att erhålla excitationsspektra) och högkänsliga hybriddetektorer, som, i kombination med superupplösningstekniker, möjliggör spektralinformation och lokalisering av proteiner med nanometrisk upplösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Denna forskning genomfördes som en del av projekten TIN2015-68454-R och 20961/PI/18, finansierade av det spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft och Séneca-stiftelsen i Murcia-regionen. Irene Hernández Martínez och Francisco Javier Ibáñez López från avdelningen för statistiskt stöd vid det vetenskapliga och forskningsområdet vid Murcia University (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (figur 1 ritades med hjälp av bilder från Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier är licensierat med en Creative Commons Attribution 3.0 Unported-licens (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | - |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | - |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | - |
| red filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | - | - |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
References
- Vis, M. L., Necchi, O. Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , Springer Nature. (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
- Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
- Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
- Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , Dresden. (2000).
- Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
- Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
- Grigoryeva, N. Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
- Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
- Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
- Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
- Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
- Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
- Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
- Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
- Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
- Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
- Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
- Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
- Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
- Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
- Universität Gottingen-Georg-August.
- Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).
- Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
- Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
- Field, A. M. Discovering Statistics Using R. , (2013).
- Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
- Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2011).
