Summary
Denne protokol beskriver trin-for-trin autofluorescensbilleddannelse og evaluering af fykobiliproteinændringer i rødalger baseret på spektralanalyse. Dette er en etiketfri og ikke-destruktiv metode til evaluering af cellulær tilpasning til ekstreme levesteder, når kun knappe materialer er tilgængelige, og celler vokser langsomt eller slet ikke under laboratorieforhold.
Abstract
Rødalger (Rhodophyta) indeholder phycobiliproteiner og koloniserer levesteder med svagt lys, men nogle (f.eks. Nogle Chroothece-arter ) kan også udvikle sig i fuld solskin. De fleste rhodophytes er røde, men nogle kan forekomme blålige, afhængigt af andelen af blå og røde biliproteiner (phycocyanin og phycoerythrin). Forskellige phycobiliproteiner kan fange lys ved forskellige bølgelængder og overføre det til klorofyl a, hvilket gør fotosyntese under meget forskellige lysforhold mulige. Disse pigmenter reagerer på habitatændringer i lys, og deres autofluorescens kan hjælpe med at studere biologiske processer. Ved hjælp af Chroothece mobilis som modelorganisme og spektral lambdascanningstilstand i et konfokalmikroskop blev tilpasningen af fotosyntetiske pigmenter til forskellige monokromatiske lys undersøgt på celleniveau for at gætte artens optimale vækstbetingelser. Resultaterne viste, at selv når den undersøgte stamme blev isoleret fra en hule, tilpassede den sig både svage og mellemstore lysintensiteter. Den præsenterede metode er især nyttig til at studere fotosyntetiske organismer, der ikke vokser eller vokser meget langsomt under laboratorieforhold, hvilket normalt er tilfældet for dem, der lever i ekstreme levesteder.
Introduction
Rødalger, såsom slægten Chroothece, kan vokse i ekstreme levesteder, hvor de ofte skal klare markante miljøændringer1. Oversvømmelser og tørke er hyppige i halvtørre områder, hvor denne slægt kan findes, og nogle arter er blevet rapporteret i åer, klipper, huler eller endda termiske farvande2. Men det meste af tiden henviser biologiske variabler, såsom konkurrence eller græsning, arter til ikke-optimale betingelser for deres vækst. Da disse organismer ofte er vanskelige at dyrke og enten ikke vokser eller vokser meget langsomt under laboratorieforhold, er en væsentlig begrænsning den tilgængelige prøvestørrelse. Derfor er det meget vigtigt at følge ikke-destruktive metoder eller metoder, der involverer minimal prøvemanipulation 3,4.
De fysiologiske færdigheder, der er nødvendige for at overleve i disse barske miljøer, kan overvåges ved at følge ændringer i deres fotosyntetiske systemer. Metaboliske mekanismer, fotosyntetisk effektivitet og følsomhed over for lys- eller kulturbetingelser kan afsløres ved pigmentfluorescensemissionsprofiler på grund af nøjagtige ændringer i deres energioverførsel eller fangst 5,6,7,8.
Autofluorescens af cellulære forbindelser kan anvendes som markør for cytodiagnose eller som en naturlig indikator for cellulær tilstand eller metabolisme som reaktion på eksterne og interne signaler gennem ændringer i emission9. Det kan også bruges til at skelne taksonomisk forskellige grupper af fotosyntetiske organismer10. Afhængigt af den fylogenetiske position af fototrofe mikroorganismer kan man finde forskellige in vivo fluorescensegenskaber. Derfor er en taksonomisk identifikation baseret på in vivo-karakteristika for fototrofisk fluorescens (herunder fluorescensabsorption og emissionsspektre) blevet forsøgt ved flere lejligheder11,12. På grund af mangfoldigheden i tilbehørspigmenter blandt fytoplanktontaxa kan forskelle i bølgelængderne, ved hvilke klorofyl a (Chl a) fluorescens stimuleres, eller forskelle i emissionsspektre anvendes til at udlede taksonomi13. In vivo fluorescensexcitations- og emissionsspektrene for disse prøver er ikke kun afhængige af algernes phyla, men også af fotosystemtilpasning14. Effektiviteten af energioverførsel til Chl a eller forholdet mellem Chl a og tilbehørspigmenter og det cellulære pigmentindhold er følsomme over for vækstbetingelser5.
Rødalger, især Chroothece, har flere tilbehør fluorescerende pigmenter-phycobiliproteiner og carotenoider; Det førstnævnte koncentrat i phycobilisomer bundet til thylakoiderne af kloroplaster. Phycobiliproteiner (phycocyanin, phycoerythrin, og allophycocyanin) kan fange lys ved forskellige bølgelængder og overføre det til Chl a, hvilket gør fotosyntese i meget forskellige lys- og kulturforhold mulig15. For eksempel kan Chroothece-arter vokse inde i huler eller næsten dukke op i let saltholdige kalkholdige vandløb2.
Monokromatiske lys påvirker væksten og pigmentsammensætningen af fotosyntetiske organismer og er blevet undersøgt for at forhindre eller kontrollere væksten af fotosyntetiske organismer i huler. Mulec et al. viste, at rød beriget belysning fremmer væksten af cyanobakterier, alger og planter16. Tidligere undersøgelser har også rapporteret, at grønt lys påvirker pigmentsammensætningen af cyanobakterier17, mens andre har afsløret, at grønt lys forhindrer væksten af de fleste fotosyntetiske organismer, og nogle cyanobakterier udviser en reduktion i thylakoider og svagere gennemsnitlig fluorescensintensitet18.
For at forstå Chrootheces evne som modelorganisme til at overvinde barske forhold er dyrkede celler blevet udsat for stigende lysintensiteter og monokromatisk lys (grønt eller rødt)15 for at se, hvordan det håndterer de svage forhold i huler (hvor rødt lys dominerer). Protokollen præsenteret heri reproducerer effekten af ovennævnte variabler på Chroothece's phycobiliproteiner på celleniveau ved hjælp af sin egen autofluorescens.
I dag bruges fluorescens almindeligvis som et værktøj til at studere de fysiologiske reaktioner hos vaskulære planter, mikroalger, makroalger og cyanobakterier13,14,16. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi er et fremragende værktøj til in vivo-undersøgelser til evaluering af fotosyntetiske prøvers fysiologi på enkeltcelleniveau 10,17,18,19,20 ved at undgå problemer forbundet med den lave væksthastighed i laboratoriet og vanskelighederne med at opnå tilstrækkelig biomasse til de tilknyttede ekstraktions- og biokemiske metoder 8 . Når cellerne er behandlet under forskellige dyrkningsbetingelser i 2 uger, kan lambdascanningsprofilen måles in vivo. Selv om der er flere publikationer, hvor forskellige bølgelængder af excitation ved konfokal billeddannelse er blevet anvendt 3,4,10,17, kan de fleste phycobiliproteiner og Chl a detekteres ved hjælp af en 561 nm bølgelængde excitationslinje, og den detekterede emission varierer fra 570 til 760 nm bølgelængde. Disse kriterier er baseret på en analyse, der tidligere er udført 10 med kommercielle rene pigmenter (tabel 1) ved konfokal billeddannelse og de opnåede resultater i forskellige algeart20,21,22.
| Pigmenter | λflmax (nm) | λ exc (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11,2 ± 0,2 | 1.8 ± 0.05 | 2,0 ± 0,08 | 12,2 ± 0,7 | 6,0 ± 0,3 | 4.2 ± 0.16 | 80,7 ± 1,5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 11,1 ± 0,04 | 42,2 ± 0,3 | 100,0 ± 0 | 90,0 ± 0,3 | 99,2 ± 0,08 | - |
| 652.1-668.6 | - | - | 1,5 ± 0,01 | 3.7 ± 0.04 | 26,7 ± 0,5 | 8,7 ± 0,16 | 11.1 ± 0.16 | 11.3 ± 0.2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1,0 ± 0,01 | 0,6 ± 0,004 | 0.7 ± 0.008 | 2,0 ± 0,08 | 2,0 ± 0,04 | 3.3 ± 0.16 | 33,6 ± 0,9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15.1 ± 1.5 | 9,6 ± 0,98 | 1,0 ± 0,04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.1 ± 0.5 | 23.2 ± 3.5 | 91,4 ± 2,3 |
Tabel 1: De rene pigmentoplysninger, der bruges til at køre lambdascanningsanalysen. Denne tabel viser emissionstoppe og skuldre/fluorescensbåndmaksima for forskellige fluorkromer/pigmenter ved konfokal billedspektrofotometri for alle excitationsbølgelængder og procentdelen af lysemission fra pigmenter/fluorkromer. Værdierne blev beregnet ved hjælp af formlen: = MFI*100/255. Hver værdi er middelværdien ± SE (middelværdi ± standardfejl fra middelværdien). Rene pigmenter blev anvendt til kalibrering af det konfokale scanningslasermikroskop som følger: 1,2,10. Klorofyl a blev opnået fra Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) fra Porphyra tenera og C-phycocyanin (C-PE) fra Spirulina sp. Alle arterne blev opløst i filtreret destilleret vand. Allophycocyanin-XL (APC-XL) blev opnået fra Mastigocladus laminosus, som blev opløst i ammoniumsulfat (60%) og kaliumphosphat (pH = 7) for at opnå en koncentration på 38 mM. Scanningerne blev udført med 400 μL af hver pigmentopløsning (koncentration på 1 mg/ml) ved hjælp af et 8-brønds dækket glasbundkammer.
Undersøgelsen af en enkelt excitationsbølgelængde er en ganske nyttig første tilnærmelse. I dette tilfælde er det imidlertid nødvendigt at belyse det relative bidrag fra de forskellige komplekser i fluorescenssignalet, hvilket anbefales at udføre et fluorescensforhold eller spektrumanalyse ved flere bølgelængder blandt andre metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Algearten Chroothece mobilis blev anvendt til denne undersøgelse. Arten blev opnået fra Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29 kultursamling. En oversigt over protokollen er vist i figur 1.
Figur 1: Oversigt over undersøgelsen. Chroothece mobilis inkuberes under ekstreme habitatforhold, såsom forskellige monokromatiske lys, i 2 uger. Effekten på Chrootheces fysiologi evalueres ved autofluorescens af proteinerne indeholdt i fykobilisom og fotosystemer ved hjælp af et konfokal laserscanningsmikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Forberedelse af prøver
- Forbered inokulum af Chroothece mobilis fra agarkulturen i samlingen ved at overføre det til SWES flydende medium (tabel 2).
BEMÆRK: SWES "Seewasser + Erddekokt + Salze" = havvandsmedium23. - Alle kulturer opretholdes i 2 uger med en fotoperiode på 16:8 lys/mørke ved 20 °C under lav intensitet af hvidt lys (LL: 80 μM/m2/s) og uden omrystning, indtil den ønskede celletæthed opnås (se trin 1.3).
BEMÆRK: Vækstlysforholdene er 80 μM/m2/s lysintensitet (aktiv fotosyntetisk stråling, PAR). Disse forhold bruges som dårlige lysforhold (kontrol). SWES-substratets sammensætning fremgår af tabel 2. - Udfør podninger for de forskellige eksperimenter i den eksponentielle kulturfase med en celletæthed på 5 x 103 celler / ml i en 24-brøndplade ved hjælp af 1 ml pr. Brønd.
BEMÆRK: Udfør celletælling med et Neubauer-kammer24, og fortynd kulturen med SWES, når det er nødvendigt.
| SWES medium sammensætning | |
| Komponent | Koncentration |
| KNO3 | 1,98 mM |
| K2HPO4 | 115 μM |
| MgSO4 | 81 μM |
| ZnSO4, 7H2O | 17 nM |
| MnSO4, 7H2O | 45 nm |
| H 3BO3, 4H2O | 3,1 mM |
| CO(NR.3)2 | 17 mM |
| Na 2 MoO4, 6H2O | 21 nM |
| CuSO4, 2H2O | 0,1 nM |
| FeSO4, 5H2O | 13 μM |
| EDTA, 7H2O | 11 μM |
| Vit B12 | 5 μg |
| Jordekstrakt | 30 ml |
| Filtreret flodvand | 455 ml |
Tabel 2: SWES-middelsammensætning.
2. Reproduktion af ekstreme alger habitatbetingelser: grøn og rød monokromatisk lyseffekt
- Der tilsættes 1 ml cellekultur fra stamkulturen fremstillet ved ovennævnte celletæthed (trin 1.2) for at pode hvert hul i en plade med 24 huller.
- Hold cellekulturen dækket i 2 uger for at reproducere den monokromatiske lyseffekt.
- Brug det grønne filter, der tillader grønt lys at passere igennem fra 470 til 570 nm med en top ved bølgelængden 506 nm (i henhold til producentens specifikationer; se materialetabel) og udsæt det for kulturen25.
- Brug det røde filter, der tillader rødt lys mellem 590 og 720 nm og toppe ved 678 nm (i henhold til producentens specifikationer; se materialetabel) for at udsætte det for kulturen25.
BEMÆRK: Den lave hvide lysintensitet (LL: 80 μM / m2 / s; se materialetabel) tilstand bruges som lysintensitetskontrol til at sammenligne de opnåede effekter. De anvendte lysintensitetsenheder er mikromol per sekund og kvadratmeter (μmol m-2 s-1) eller fotosyntetisk fotonfluxtæthed (PPFD).
3. Autofluorescensbilleddannelse
BEMÆRK: Opsætningen af billedbehandlingssoftwaren (se materialetabellen) er illustreret i figur 2.
- Tænd for alle komponenterne i det inverterede konfokale laserscanningsmikroskop (CLSM; se materialetabellen), inklusive laseren.
- Monter cellerne fra hver forsøgsbrønd i 24-brøndpladen i SWES-vækstmedium på en 35 mm glasbundskål (se materialetabel) til billeddannelse.
- Vælg 63x/1.30 NA glycerol nedsænkningsmålet og placer glycerol over linsen (se materialetabel).
- Placer brøndpladen på mikroskoptrinnet, og sørg for, at prøven ikke bevæger sig under billedoptagelse.
- Centrer prøven i lysbanen og fokuser på midten af cellen ved at vælge planet med den højeste fluorescensintensitet.
- Åbn billedoptagelsessoftwaren, og vælg xyλ fra rullelisten i anskaffelsestilstand26.
- Vælg laserens excitationslinje til 561 nm DPSS, 8 bit dynamisk område og 1024 x 1024 pixels.
BEMÆRK: Sørg for, at det konfokale mikroskop har en 561 nm DPSS-laser eller en hvid lyslaser (WLL). - Fluorescensemissionsspektrene indsamles i båndbredden på 10 nm og lambdatrinstørrelsen på 4 nm inden for området 570-760 nm.
- Indstil pinhole til 1 Airy-enhed, og kør lambdascanningen.
- Gentag denne proces så mange gange som muligt i forskellige synsfelter for at indsamle en acceptabel mængde data til statistisk analyse (normalt en standardafvigelse lavere end 10%22).
- Gentag det sidste trin under de forskellige betingelser (under rødt og grønt lys), og gem dataene.
BEMÆRK: Brug de samme anskaffelsesindstillinger for de forskellige stikprøver og betingelser til at sammenligne og udføre den statistiske analyse.
Figur 2: Opsætning af software. Brugergrænseflade til billedbehandlingssoftware til opsætning af lambdascanningsparametre. (A) Fra venstre mod højre for at vælge anskaffelsestilstanden xyλ fra rullelisten, der svarer til trin 3.6 i protokollen, og for at vælge den højre nedsænkningslinsetype, der svarer til trin 3.3 i protokollen. Sørg for at fjerne eventuelle filtre fra lysbanen i trin 3.9. (B) Panelet til opsætning af lambdascanningsparametrene svarer til trin 3.8 i protokollen. (C) Kør lambdascanningen i trin 3.10. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Parametre til evaluering af Chrootheces fysiologi
- Når lambdascanningen er opnået, skal du klikke på kvantificeringsvinduet øverst i softwaren (som vist i figur 3) for at evaluere de indsamlede fluorescensemissionsspektre. Gå til vinduet Åbn projekt , og vælg en xyλ-fil (figur 3).
- Vælg Stakprofilanalyse i billedbehandlingssoftwaren.
- Definer et interesseområde (ROI) på 4 μm2 i midten af en celle for at analysere den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI). Eksportér dataene i CSV-format.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå tilstedeværelsen af sorte pixels (for at sikre, at de valgte pixels indeholder positive værdier) og altid opretholde et investeringsafkast af samme størrelse. - Gentag denne proces med forskellige celler under forskellige forhold for at producere nok data til at udføre statistisk analyse.
- Åbn CSV-filerne for at vælge de forskellige fluorescenstoppever fra phycobiliproteinerne og klorofylerne for alle de målte ROI'er.
- Vælg fluorescensdata for henholdsvis phycoerythrin-phycocyanobilin (PE-PCB; 620 nm), C-phycocyanin (CPC; 648 nm), allophycocyanin (APC; 660 nm) og chlorophyll a (Chl a; 680 nm) i csv-filen.
- Opret en ny tabel med alle de maksimale fluorescensværdier, der er opnået fra hver phycobiliprotein- og klorofyltop, og plot dataene på en graf.
- Udfør statistisk analyse.
- Analyser, om de opnåede data opfylder normalitet og homoscedasticitet27.
- Fortsæt til t-testanalysen27,28, hvis den første betingelse er sand. Hvis ikke, skal du køre en Mann-Whitney U-test29.
- Overvej forskellene signifikante ved p-værdier <0,05.
Figur 3: Evaluering af Chroothece's autofluorescens. For at udføre autofluorescensanalysen skal du sørge for at vælge kvantificeringsvinduet og en xyλ-fil i det åbne projektvindue (trin 4.1); vælg Stack Profile Visualization (trin 4.2); vælg et investeringsafkast på 4 μm2 i midten af en celle, og klik på rapportknappen for at eksportere lambdascanningsdataene i CSV-format (trin 4.3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Klorofyl a absorberer generelt blå og røde bølgelængder af synligt lys, mens phycobiliproteiner bruger grønne, gule og orange bølgelængder7. Autofluorescensen af disse pigmenter gør den første tilgang til at studere phycobiliproteiner og klorofyladfærd under eksperimentelle og feltbetingelser mulig.
Ved at sammenligne de opnåede data og plotte på forskellige grafer kan der skelnes mellem signifikante ændringer i gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) (figur 4). En skjult statistisk undersøgelse af de forskellige emissionstoppe opnået i lambdascanningsprofilerne (620, 648, 660 og 680 nm) viste signifikante forskelle (statistisk signifikans: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).
MFI'en for PE-PCB faldt signifikant, når cellerne blev udsat for grønt monokromatisk lys (GL), men der blev ikke observeret nogen forskel i forhold til kontrollen i rødt lys (RL) (figur 4A). GL havde imidlertid den modsatte effekt på APC og Chl a (figur 4B, C), hvor MFI'en steg signifikant på grund af tilpasningen af antennekomplekser på grund af enten en øget mængde eller forbedret tilslutning af antennekomplekserne, blandt andre. RL producerede en ikke-signifikant stigning i både APC og Chl a fluorescens 17,24,25,26.
Figur 4: Virkninger på fluorescensen af Chroothece phycobiliproteiner og klorofyl a under monokromatisk lysbehandling. (A-C) Fluorescensemissionsintensiteten opnået ved 561 nm excitationsbølgelængden i lambdascanningen og efter at have analyseret dataene relateret til forskellige fycobiliproteiner (A: PE-PCB; B: APC) og klorofyl (C: Chl a). Kasser indeholder de afbildede median-, minimum- og maksimumværdier for fluorescensemissionsintensitet. Grønne kasser: grøn monokromatisk lystilstand (GL); røde bokse: rødt monokromatisk lys (RL); og blå bokse: svagt lys (LL, kontrol). Statistisk signifikans: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nogle encellede eller koloniale rødalger, såsom Chroothece, vokser langsomt in vitro, men indeholder flere autofluorescerende forbindelser, der kan analyseres ved spektralanalyse under et konfokalmikroskop, hvor forskelle i pigmentemissionstoppe kan detekteres. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi har gjort det muligt for os at gennemføre in vivo-undersøgelser for at evaluere tilpasningen eller akklimatiseringen af fotosyntetiske organismer 8,10,17,18,19,20. De fleste andre teknikker, såsom proteinanalyse, kræver store mængder prøver, er destruktive eller er meget dyrere.
Bølgelængden på 561 nm blev valgt her, da den er mere selektiv for phycobiliproteiner (baseret på en tidligere rapport23); Det bekræftede resultaterne af en tidligere undersøgelse af GL-effekterne på cyanobakterier ved hjælp af tre forskellige excitationsbølgelængder (351, 488 og 543 nm). For at opnå pålidelige data er det afgørende at erhverve alle data under de samme mikroskopbetingelser.
Denne protokol er en nem første tilgang til at studere Chroothece-cellernes opførsel under forskellige lysforhold, mens den også giver mulighed for at opnå betydelige forskelle i sammensætningen af phycobiliprotein eller klorofyl, der er blevet behandlet under forskellige monokromatiske lysforhold takket være den udførte analyse. Dette hjælper med at evaluere, hvordan rødalgeceller reagerer på ændringer i habitatforhold og lære deres tilpasningsevne til ekstreme levesteder.
Algeceller er meget rige på autofluorescerende pigmenter (klorofyl, phycobiliproteiner, carotenoider), med fluorescens, der spænder over en bred vifte af bølgelængder. Denne kendsgerning kan komplicere CLSM-billedanalyse; fluorescens levetid billeddannelse (FLIM), spektral unmixing og excitation af den hvide laser kan dog hjælpe med at adskille signaler30,31. En god sammenhæng findes normalt mellem den fysiologiske tilstand og fotosyntetisk pigmentydelse i mikroalger3.
Ikke desto mindre er destruktive teknikker obligatoriske for at vurdere ændringer i det relative bidrag fra forskellige fluorescenskomplekser i fluorescenssignalet eller for at udføre et fluorescensforhold og / eller spektrumanalyse ved flere excitationsbølgelængder.
Anvendelse af denne metode er især vigtig, når knappe materialer er tilgængelige, og / eller celler enten ikke vokser eller vokser meget langsomt under laboratorieforhold. Spektralteknologier kan tilbyde fremskridt som hvide lyslasere (for at opnå excitationsspektre) og højfølsomme hybriddetektorer, som, når de kombineres med superopløsningsteknikker, gør det muligt at opnå spektral information og placering af proteiner med en nanometrisk opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Denne forskning blev udført som led i projekterne TIN2015-68454-R og 20961/PI/18, finansieret af det spanske ministerium for økonomi og konkurrenceevne og Séneca Foundation i Murcia-regionen. Irene Hernández Martínez og Francisco Javier Ibáñez López fra sektionen for statistisk støtte på det videnskabelige område og forskningsområdet ved Murcia Universitet (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (figur 1 blev tegnet ved hjælp af billeder fra Servier Medical Art. Servier Medical Art af Servier er licenseret med en Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | - |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | - |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | - |
| red filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | - | - |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
References
- Vis, M. L., Necchi, O. Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , Springer Nature. (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
- Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
- Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
- Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , Dresden. (2000).
- Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
- Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
- Grigoryeva, N. Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
- Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
- Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
- Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
- Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
- Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
- Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
- Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
- Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
- Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
- Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
- Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
- Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
- Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
- Universität Gottingen-Georg-August.
- Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).
- Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
- Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
- Field, A. M. Discovering Statistics Using R. , (2013).
- Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
- Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2011).
