Summary
La legatura parziale del nervo sciatico induce dolore neuropatico cronico di lunga durata, caratterizzato da risposte esagerate agli stimoli termici e meccanici. Questo modello murino di dolore neuropatico è comunemente usato per studiare terapie innovative per la gestione del dolore. Questo articolo descrive in dettaglio la procedura chirurgica per migliorare la standardizzazione e la riproducibilità.
Abstract
La gestione del dolore cronico rimane impegnativa fino ad oggi e i trattamenti attuali sono associati a effetti avversi, tra cui tolleranza e dipendenza. Il dolore neuropatico cronico deriva da lesioni o malattie nel sistema somatosensoriale. Per studiare potenziali terapie con effetti collaterali ridotti, i modelli di dolore animale sono il gold standard negli studi preclinici. Pertanto, modelli ben caratterizzati e ben descritti sono cruciali per lo sviluppo e la convalida di terapie innovative.
La legatura parziale del nervo sciatico (pSNL) è una procedura che induce dolore neuropatico cronico nei topi, caratterizzata da ipersensibilità meccanica e termica, dolore continuo e cambiamenti nella temperatura degli arti, rendendo questo modello perfetto per studiare il dolore neuropatico in modo preclinico. pSNL è un modello vantaggioso per studiare il dolore neuropatico in quanto riproduce molti sintomi osservati negli esseri umani con dolore neuropatico. Inoltre, la procedura chirurgica è relativamente veloce e semplice da eseguire. Il pSNL unilaterale di un arto consente il confronto tra le zampe omolaterali e controlaterali, nonché la valutazione della sensibilizzazione centrale.
Per indurre ipersensibilità neuropatica cronica, viene utilizzato un filo di nylon 9-0 non assorbibile per legare il terzo dorsale del nervo sciatico. Questo articolo descrive la procedura chirurgica e caratterizza lo sviluppo del dolore neuropatico cronico attraverso più test comportamentali comunemente usati. Poiché una pletora di terapie innovative sono ora in fase di studio per il trattamento del dolore cronico, questo articolo fornisce concetti cruciali per la standardizzazione e una descrizione accurata degli interventi chirurgici necessari per indurre dolore neuropatico.
Introduction
Il dolore cronico è un problema sanitario significativo in tutto il mondo ed è uno dei problemi di salute più costosi negli Stati Uniti. Il dolore cronico è meglio gestito quando entrambe le modalità farmacologiche e non farmacologiche sono utilizzate in modo multidisciplinare1. La gestione del dolore cronico è impegnativa e, in alcuni casi, non tratta adeguatamente il dolore2. Pertanto, sono necessari metodi nuovi e complementari per migliorare la gestione del dolore cronico e i modelli animali sono cruciali per studiare terapie innovative.
Il dolore neuropatico cronico deriva da lesioni o malattie nel sistema somatosensoriale, tra cui diabete, infezioni, compressioni nervose o malattie autoimmuni3. Il dolore neuropatico si basa sia sui meccanismi di sensibilizzazione periferica che centrale e ha origine da una lesione dei nervi. Questo dolore può essere caratterizzato da iperalgesia e allodinia evocate sia dal tatto che da quelle termiche, dolore continuo e cambiamenti nella temperatura dell'arto interessato4. Per comprendere meglio i meccanismi e far avanzare nuovi trattamenti, sono stati sviluppati diversi modelli nei roditori per imitare i sintomi e le cause del dolore neuropatico5. Ad esempio, il dolore neuropatico può essere indotto con iniezioni di agenti chemioterapici, legatura del nervo spinale (SNL), lesione cronica da costrizione (CCI) del nervo sciatico, pSNL, lesione nervosa risparmiata, transezione del nervo sciatico e trisezione del nervo sciatico6. In particolare, la legatura del nervo sciatico riproduce molteplici caratteristiche del dolore neuropatico osservate nell'uomo, come l'ipersensibilità meccanica e termica o i cambiamenti di temperatura dell'arto interessato, caratteristici della sindrome dolorosa regionale complessa (CRPS)7. Pertanto, questo modello è adatto per lo studio della CRPS o di qualsiasi altra affezione di lesioni nervose che inducono dolore neuropatico cronico. Il modello è stato sviluppato per la prima volta da Seltzer nel 19908 ed è ampiamente utilizzato negli studi sul dolore per studiare nuovi composti analgesici o valutare gli effetti cognitivi del dolore cronico 9,10,11,12,13. Il modello presenta un'elevata riproducibilità e la legatura parziale preserva le risposte comportamentali agli stimoli periferici6.
Molti dei modelli attualmente utilizzati presentano carenze non osservate in pSNL. Il modello CCI ha una variabilità molto più elevata di lesioni tra ciascun animale a seconda dell'aderenza del costrittore e l'autotomia altera le dita della zampa posteriore rendendo il modello inadatto all'analisi comportamentale6. Il modello SNL è un intervento chirurgico molto più complicato e più lungo che non solo richiede competenze tecniche avanzate, ma comporta anche un alto rischio di gravi deficit motori3. Queste carenze non sono viste nel modello pSNL. La facilità di riproducibilità, la breve durata dell'intervento chirurgico e il ridotto rischio di deficit motori osservati postoperatoriamente rendono questo modello prezioso per lo studio del dolore neuropatico periferico 8,14. Tuttavia, la stessa procedura di legatura parziale può avere variabilità tra gli sperimentatori, con conseguente minore coerenza nel numero di fibre nervose legate. Pertanto, presentare i dettagli dell'intervento chirurgico è fondamentale per aumentare la riproducibilità tra gli studi.
Per indurre la neuropatia cronica, viene utilizzata una sutura di nylon non assorbibile 9-0 per ligare un terzo della larghezza del nervo sciatico. Dopo l'intervento chirurgico, le risposte agli stimoli termici e meccanici sono esagerate, iniziando al giorno 1 postoperatorio e durando più di 50 giorni8. Qui, sia le sensibilità termiche che meccaniche sono state valutate per 28 giorni utilizzando i test del filamento di Hargreaves, della piastra calda e di von Frey. Tutti i test comportamentali hanno dimostrato la coerenza dell'ipersensibilità di lunga durata. Questo modello ha dimostrato di avere effetti dose-dipendenti sia della morfina che dell'ibuprofene, confermando che è adatto per studi preclinici sul dolore. In particolare, questo articolo descrive le istruzioni per uno strumento di vetro fatto a mano unico, indicato come "gancio di vetro nervoso". Questo strumento viene utilizzato al posto del forcipe per manipolare il nervo e prevenire ulteriori lesioni nervose non intenzionali durante l'intervento chirurgico.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università dell'Arizona e sono conformi alle linee guida per l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health (pubblicazione NIH n. 80-23, 1966). I topi adulti C57Bl6/J privi di agenti patogeni (peso al test: 22-28 g) sono stati alloggiati in gabbie standard per topi vivarium (cinque topi per gabbia) in stanze climatizzate con un ciclo luce/buio di 12 ore e hanno avuto accesso a cibo e acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti comportamentali sono stati condotti da sperimentatori ciechi alle condizioni di trattamento.
1. Baseline: la misura della sensibilità meccanica
- All'arrivo dei topi, consentire loro di abituarsi alla struttura per animali per 1 settimana. Quindi, abituare gli animali alla manipolazione sperimentale per ≥7 giorni successivi.
- Abituare i topi all'apparecchiatura di prova di von Frey per 1 ora prima del test mettendoli in scatole di plexiglas trasparenti, su una rete metallica, nella stessa stanza della sala di prova, preferibilmente con lo sperimentatore presente nella stanza durante l'assuefazione.
- Stabilire la soglia di prelievo della zampa basale tramite il metodo "up-and-down" utilizzando filamenti di von Frey descritti nella Tabella supplementare S1, a partire dal filamento di 3,61 (3,9 mN).
- Misurare la risposta di ritiro al sondaggio della zampa posteriore medio-plantare con una serie di monofilamenti fini calibrati (von Frey). Applicare ciascun filamento perpendicolarmente una volta sulla superficie plantare della zampa posteriore omolaterale pSNL degli animali tenuti in gabbie di rete metallica sospese. Valutare la sensibilità meccanica utilizzando il metodo "up-and-down"15: determinare la soglia di prelievo aumentando o diminuendo sequenzialmente la forza dello stimolo, corrispondente alla dimensione del filamento. Applicare sequenzialmente ogni filamento una volta.
NOTA: Lo sperimentatore deve evitare di stimolare uno qualsiasi dei cuscinetti per ottenere risultati coerenti tra gli animali. - Ad esempio, se l'animale non risponde al filamento 3,61, utilizzare il filamento 4,08 più spesso (9,8 mN) (una risposta è notata visivamente come ritiro, scuotimento o leccatura della zampa interessata); se l'animale ha risposto la prima volta, utilizzare il filamento più sottile da 3,22 (1,6 mN). Continuare a utilizzare filamenti sempre più spessi o in diminuzione a seconda che l'animale abbia avuto risposte successive positive o negative, rispettivamente. Segnalare le risposte negative e positive nella scheda tecnica presentata nella tabella supplementare S1. Prova la stessa zampa 4x con filamenti diversi dopo la prima risposta positiva.
- Misurare la risposta di ritiro al sondaggio della zampa posteriore medio-plantare con una serie di monofilamenti fini calibrati (von Frey). Applicare ciascun filamento perpendicolarmente una volta sulla superficie plantare della zampa posteriore omolaterale pSNL degli animali tenuti in gabbie di rete metallica sospese. Valutare la sensibilità meccanica utilizzando il metodo "up-and-down"15: determinare la soglia di prelievo aumentando o diminuendo sequenzialmente la forza dello stimolo, corrispondente alla dimensione del filamento. Applicare sequenzialmente ogni filamento una volta.
2. Baseline: la misura della sensibilità termica utilizzando il test di Hargreaves
- All'arrivo dei topi, consentire loro di abituarsi alla struttura per animali per 1 settimana. Quindi, abituare gli animali alla manipolazione sperimentale per ≥7 giorni successivi.
- Abituare i topi all'apparecchiatura di prova Hargreaves per 1 ora prima del test mettendoli in scatole di plexiglas trasparenti, nella stessa stanza della sala di prova, preferibilmente con lo sperimentatore presente nella stanza durante l'assuefazione.
NOTA: Il test di Hargreaves richiede che l'animale rimanga fermo per alcuni secondi. Con i topi, l'assuefazione è la chiave per un esperimento di successo. Pertanto, se i topi rimangono molto attivi dopo 1 ora di assuefazione, consentire loro di acclimatarsi più a lungo secondo necessità.- Determinare le latenze di prelievo della zampa come descritto da Hargreaves et al.16. Acclimatare i topi all'interno di involucri in plexiglas su una lastra di plexiglass trasparente.
- Focalizzare una fonte di calore radiante (lampada del proiettore ad alta intensità) sulla superficie plantare della zampa posteriore omolaterale al pSNL. Regolare l'intensità della fonte di calore per ottenere una latenza di prelievo della zampa di circa 10 s. Quindi, mantieni costante l'intensità per il resto dell'esperimento.
- Attendi che un rilevatore di movimento fermi automaticamente lo stimolo e il timer quando la zampa viene ritirata. Utilizzare un cutoff massimo di 33,5 s per prevenire danni ai tessuti.
NOTA: Il cut-off è determinato sulla base di esperimenti e articoli precedenti per evitare ulteriori danni alla pelle11,17,18. Con l'intensità utilizzata in questo studio, 33,5 è il cut-off, corrispondente a un'intensità di stimolo di 30 (50 W) utilizzando l'apparato di Hargreaves. Il comportamento osservato è un comportamento riflesso, non volontario. - Stabilire le latenze di prelievo della zampa basale utilizzando l'apparato di Hargreaves e mirando alla superficie plantare della zampa posteriore omolaterale pSNL. Inizia la stimolazione termica e registra la latenza di prelievo. Per evitare di influenzare la temperatura dello stimolo termico, pulire l'urina durante le prove.
3. Baseline: la misura della sensibilità termica utilizzando il test della piastra calda
- Abituare gli animali alla sala prove per 1 ora prima del test.
NOTA: Poiché la temperatura ambiente è importante e può influenzare le risposte al test della piastra calda, assicurarsi che la temperatura della stanza sia costantemente intorno ai 22 °C durante il periodo di assuefazione e durante il periodo di prova. - Impostare la piastra riscaldante a 52 °C, poiché è stato dimostrato che questa temperatura suscita idealmente una risposta termica avversiva19.
- Posizionare l'animale nella camera di prova e avviare un cronometro.
- Osservare i comportamenti nocifensivi (ad esempio, ritiro della zampa, leccare, scuotere). Poiché la chirurgia pSNL colpisce l'arto posteriore, ignorare qualsiasi comportamento osservato negli arti anteriori (in particolare leccare gli arti anteriori).
- Arrestare il cronometro non appena si osserva un comportamento nocifensivo.
- Rimuovere l'animale dalla camera e registrare la latenza a questo comportamento.
NOTA: Rimuovere gli animali dalla camera dopo un massimo di 30 secondi per evitare danni ai tessuti. Inoltre, è importante notare che il comportamento osservato è un comportamento riflesso, non volontario. - Pulire la camera di prova con etanolo al 70% tra gli animali per ridurre l'impatto comportamentale degli odori. Per evitare di influenzare la temperatura dello stimolo termico, pulire l'apparato di qualsiasi urina tra ogni animale testato.
- Per confermare i risultati, registrare video degli animali nella camera della piastra calda durante i test per la revisione dopo che gli animali sono stati testati.
NOTA: utilizzando la revisione video per quantificare le latenze, lo sperimentatore può osservare ripetutamente il test e analizzare da vicino i comportamenti nocifensivi che potrebbero non essere stati rilevati durante l'osservazione in tempo reale.
4. Preparazione preoperatoria
NOTA: Assicurarsi che siano disponibili gabbie pulite per il recupero dei topi dopo l'intervento chirurgico. Pulire l'area chirurgica con etanolo al 70%, disinfettare le mani con etanolo al 70%, utilizzare guanti sterili, indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati (camice da laboratorio, retina per capelli, copriscarpe) e praticare tecniche sterili durante l'intervento chirurgico.
- Preparare gli strumenti (Figura supplementare S1) e le risorse aggiuntive (garze) da utilizzare in chirurgia mediante autoclave preventiva.
- Indurre l'anestesia utilizzando isoflurano volatile e regolare secondo necessità per mantenere un piano chirurgico. Assicurarsi che l'ossigeno sia a una portata appropriata.
- Per assicurarsi che l'animale sia anestetizzato, pizzicare le dita dei piedi su una zampa posteriore con una pinzetta per garantire l'assenza di riflesso della zampa e controllare il riflesso del battito delle palpebre corneale prima di applicare un unguento oftalmico lubrificante.
NOTA: Gli analgesici non possono essere offerti in questo studio in quanto possono alterare il percorso del dolore destinato ad essere analizzato o addirittura neutralizzare e invalidare il comportamento misurato in conformità con gli obiettivi di ricerca sul dolore20,21,22. - Dopo aver scelto su quale lato eseguire l'intervento chirurgico (qui è dimostrato a sinistra), radere la zampa posteriore dell'animale intorno alla regione della coscia, inferiormente verso la rotula, superiormente verso l'anca e sopra il femore. Pulire 3 volte con clorexidina in una direzione con tre garze separate, alternate a soluzione salina sterile calda.
NOTA: Andando avanti, assicurati che ogni animale abbia l'intervento chirurgico eseguito sullo stesso lato per mantenere la coerenza. - Far scivolare la gamba attraverso una fessura realizzata in un drappo sterile di 10 cm x 10 cm per creare un campo sterile attorno alla gamba scelta.
5. Procedura chirurgica
- Utilizzando sottili forbici chirurgiche (Figura supplementare S1F), effettuare un piccolo taglio di 2 mm della pelle nella linea mediana dell'aspetto laterale della coscia. Far scorrere le forbici sotto la pelle con un movimento circolare per sfondare la fascia e creare uno spazio, allargando lo spazio dell'incisione.
- Utilizzando una pinza da legatura (figura supplementare S1H), creare un'incisione affilata verticalmente con un angolo di 90 ° nei muscoli della coscia, profonda 1 cm.
- Inserire le piccole forbici sottili (Figura supplementare S1G) nella stessa incisione, anch'esse con un angolo di 90°, e aprirle delicatamente per separare i muscoli. Continuare a farlo fino a quando il nervo sciatico viene visualizzato.
- Individua il nervo sciatico, che può apparire lucido e sottile, correndo parallelo alla coscia verticale, nella direzione dell'anca al ginocchio. Rimuovere le forbici e le pinze di legatura dal corpo prima di procedere.
- Utilizzare la pinza extra fine (Figura supplementare S1D) e il gancio di vetro nervosa (Figura supplementare S1E) per isolare il nervo da sotto. Liberare con cura il nervo dai tessuti connettivi circostanti in un sito vicino al trocantere del femore, che è più vicino all'anca e più lontano dal ginocchio.
- Lasciare che il nervo si appoggi sull'asta di vetro e assicurarsi che l'estremità dell'asta impedisca al nervo di rotolare.
- Posizionare un nodo chirurgico per legare 1/3 della larghezza del nervo sciatico usando una sutura di nylon 9-0, prima di dividersi nei rami nervosi peroneali, tibiali e surali comuni3.
NOTA: La ramificazione si verifica quando il nervo sciatico scorre lungo il ginocchio, lontano dall'anca. Poiché questi tre rami del nervo hanno tre diverse innervazioni, è imperativo posizionare il nodo chirurgico prima della ramificazione per garantire gli stessi deficit nervosi in tutti gli interventi chirurgici sugli animali. - Fare attenzione a tenere i fili vicino al nodo quando si tirano i fili stretti, in modo da non tirare il nervo con forza eccessiva per evitare di far scivolare il nervo dall'asta di vetro ed evitare ulteriori lesioni da stiramento.
- Far scivolare con attenzione il nervo dall'asta di vetro una volta completato il nodo e rimetterlo nella posizione originale al livello sotto i muscoli separati.
- Suturare l'incisione muscolare utilizzando una sutura poliglicolica 5-0 assorbibile. Separatamente, suturare la pelle utilizzando una sutura in polipropilene 6-0 non assorbibile.
- Registrare il tempo di arresto dell'intervento chirurgico e dell'anestesia. Lasciare che il topo si svegli, da solo in una gabbia di recupero, prima di riportarlo in una nuova gabbia pulita.
NOTA: Durante l'intervento, pizzicare le dita dei piedi dell'animale per confermare l'adeguato mantenimento dell'anestesia e monitorare la sua respirazione e perfusione corporea (rosso, rosa, pallido). Se la respirazione è significativamente ridotta o l'animale appare pallido, considerare di ridurre il flusso di anestesia o aumentare il flusso di ossigeno e avere una siringa piena di soluzione salina pronta da iniettare per via sottocutanea per reidratare l'animale. In ogni momento, l'animale dovrebbe avere una fonte di calore posta sotto di essa per mantenere il calore del corpo.
6. Procedura di chirurgia fittizia per animali di controllo
- Seguire i passaggi 5.1-5.11 della procedura chirurgica; Escludere i passaggi 5.4-5.9.
7. Test comportamentali post-chirurgici
NOTA: Assicurarsi che lo sperimentatore sia cieco a qualsiasi trattamento. Il dolore neuropatico cronico si svilupperà in 2 settimane dopo l'intervento chirurgico, dopo di che i test comportamentali possono essere condotti dopo la somministrazione di composti di interesse.
- Utilizzare il test von Frey, Hargreaves o hot plate per valutare sia l'ipersensibilità termica che meccanica e la sua potenziale inversione.
- Rimuovere qualsiasi animale dallo studio se soddisfa i criteri endpoint descritti dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
- Eutanasia degli animali seguendo le procedure descritte dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali al termine dei test comportamentali.
8. Analisi dei dati
- von Frey:
- Analizzare i dati utilizzando il metodo non parametrico di Dixon, come descritto da Chaplan e colleghi23, ed esprimere i dati come soglia media di prelievo.
- Nella pagina principale del software di riferimento (vedere Tabella dei materiali), selezionare tutti i filamenti utilizzati per lo studio (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 e 4.56). Nel pannello del gruppo , selezionare il filamento corrispondente all'ultima simulazione. Nella casella vuota , segnalare le risposte positive (X) e negative (o). Annotare le soglie riportate nella casella a sinistra del modello di risposte osservato.
NOTA: Un esempio di modello e quantificazione è presentato nella figura supplementare S2.
- Nella pagina principale del software di riferimento (vedere Tabella dei materiali), selezionare tutti i filamenti utilizzati per lo studio (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 e 4.56). Nel pannello del gruppo , selezionare il filamento corrispondente all'ultima simulazione. Nella casella vuota , segnalare le risposte positive (X) e negative (o). Annotare le soglie riportate nella casella a sinistra del modello di risposte osservato.
- Analizzare i dati utilizzando il metodo non parametrico di Dixon, come descritto da Chaplan e colleghi23, ed esprimere i dati come soglia media di prelievo.
- Arciccioli e piastra calda:
- Segnala le latenze in un foglio di calcolo per ulteriori analisi statistiche.
- Tracciare i risultati come media delle sensibilità (soglie o latenze) in funzione del tempo.
9. Istruzioni su come realizzare il gancio di vetro nervoso
NOTA: Praticare la sicurezza antincendio durante tutto questo processo. Indossare una protezione adeguata, come guanti o occhiali resistenti al calore, se necessario.
- Accendi il bruciatore Bunsen.
- Tenere un'estremità dell'asta di vetro (A) al fuoco in una mano. Mentre questa bacchetta di vetro si scioglie, usa un'altra bacchetta di vetro (B) nell'altra mano per guidare e tirare il vetro di fusione sull'asta A. Rimuovere l'asta di vetro A dal fuoco e lasciare che l'estremità della parte fusa rotoli naturalmente verso l'interno per formare una piccola forma a sfera. Usa l'asta di vetro B per guidare questa forma.
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Representative Results
Il dolore neuropatico cronico è stato indotto attraverso la legatura parziale del nervo sciatico dei topi maschi C57Bl6/J (Figura 1A). La sensibilità meccanica è stata valutata utilizzando i filamenti di von Frey e il metodo "up-and-down". La sensibilità termica al calore è stata valutata utilizzando i test Hargreaves e hot plate. Tutti i dati sono stati analizzati con una ripetuta misura ANOVA bidirezionale con correzione Geisser-Greenhouse, per confrontare l'effetto della chirurgia pSNL su animali fittizi nel tempo o gli effetti di diverse dosi di morfina e ibuprofene.
I topi sottoposti a chirurgia pSNL hanno dimostrato soglie più basse agli stimoli meccanici rispetto agli animali fittizi per 28 giorni (Figura 1B). Risultati simili sono stati ottenuti con la valutazione dell'ipersensibilità termica; Le latenze di sospensione della zampa dopo l'esposizione allo stimolo del calore radiante sono aumentate negli animali pSNL (Figura 1C), così come le latenze di sospensione quando gli animali sono stati posti su una piastra a 52 °C (Figura 1D).
A seguito dell'instaurazione del dolore neuropatico cronico, 14 giorni dopo l'intervento, abbiamo valutato gli effetti antinocicettivi di diverse dosi di morfina o ibuprofene. I topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con soluzione salina o due diverse dosi di morfina (1 e 5 mg / kg). Entrambi i gruppi iniettati di morfina hanno mostrato un'inversione dell'ipersensibilità indotta da pSNL, che è durata da 1 (1 mg / kg) a 2 h (5 mg / kg) (Figura 2A). L'ipersensibilità meccanica è tornata al basale 4 ore dopo l'iniezione di morfina. Quando due diverse dosi di ibuprofene (10 e 30 mg/kg) sono state somministrate per via intraperitoneale ai topi, i risultati hanno dimostrato una diminuzione dell'ipersensibilità meccanica rispetto ai topi iniettati con soluzione salina (Figura 2B). Gli effetti antinocicettivi dell'ibuprofene sono durati fino a 2 ore. Nel complesso, i risultati hanno dimostrato che la chirurgia pSNL induce dolore neuropatico cronico di lunga durata. Inoltre, siamo stati in grado di dimostrare che questo modello è sensibile a diverse dosi di analgesici.
Figura 1: Ipersensibilità termica e meccanica di lunga durata nei topi dovuta alla parziale legatura del nervo sciatico. La sensibilità termica al calore (Hargreaves e test della piastra calda) e la sensibilità meccanica ai filamenti di von Frey sono state valutate per esaminare l'induzione e la persistenza dell'ipersensibilità in un modello di dolore neuropatico cronico (pSNL). I valori basali sono stati misurati prima della legatura del nervo sciatico e l'ipersensibilità è stata valutata per 28 giorni dopo l'intervento chirurgico. (A) L'illustrazione rappresenta la legatura parziale del nervo sciatico. (B) Le soglie di prelievo meccanico sono state confrontate tra topi sham e pSNL in ogni punto temporale. Ripetute misure bidirezionali ANOVA con correzione Geisser-Greenhouse hanno rivelato un effetto significativo di pSNL (F(1, 10) = 222,3, p < 0,0001, n = 5-7 per condizione). Il test di confronto multiplo di Sidak ha dimostrato un aumento significativo dell'ipersensibilità tra i giorni 1 e 28 (p < 0,05). (C) Le latenze di ritiro termico, misurate dal test di Hargreaves, sono state confrontate tra topi sham e pSNL. Ripetute misure ANOVA bidirezionali con correzione Geisser-Greenhouse hanno rivelato un effetto significativo di pSNL (F(1 , 8) = 113,8; p < 0,0001, n = 4-6 per condizione). Il test di confronto multiplo di Sidak ha dimostrato un aumento significativo dell'ipersensibilità ai giorni 2 e 14 (p < 0,05). (D) Le latenze di ritiro termico, misurate dal test della piastra calda, sono state confrontate tra topi sham e pSNL. L'ANOVA ordinaria a due vie ha rivelato un effetto significativo di pSNL (F(1, 32) = 19,10, p = 0,0001, n = 4-6 per condizione). Il test di confronto multiplo di Sidak ha dimostrato un significativo aumento della sensibilità al calore a 4 settimane dopo l'intervento chirurgico pSNL (p = 0,0026). I dati sono presentati come media ± S.E.M. Abbreviazioni: pSNL = legatura parziale del nervo sciatico; BL = linea di base. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Inversione dose-dipendente dell'ipersensibilità meccanica indotta da pSNL mediante iniezione intraperitoneale di morfina o ibuprofene. L'ipersensibilità meccanica (utilizzando filamenti di von Frey) è stata valutata per esaminare i potenziali effetti antinocicettivi della morfina o dell'ibuprofene in un modello murino di pSNL. I valori basali (pre-pSNL) sono stati acquisiti prima della legatura del nervo sciatico. A seguito dell'instaurazione del dolore neuropatico cronico, il giorno 14 gli animali sono stati messi in base una seconda volta per garantire l'ipersensibilità indotta da pSNL (post-pSNL). Quindi, due dosi di morfina (1/5 mg / kg) o ibuprofene (10/30 mg / kg) sono state iniettate per via intraperitoneale. La potenziale inversione dell'ipersensibilità meccanica è stata valutata nell'arco di 4 ore dopo le iniezioni. (A) Le soglie di sospensione meccanica sono state confrontate tra la condizione salina e le due dosi di morfina. Ripetute misure bidirezionali ANOVA con correzione Geisser-Greenhouse hanno rivelato un effetto significativo di 1 mg/kg di morfina (F(1, 11) = 11,16, p = 0,0066, n = 6-7 per condizione) e un effetto significativo di 5 mg/kg di morfina (F(1, 10) = 21,78, p = 0,0009, n = 6 per condizione). Il test di confronto multiplo di Sidak ha dimostrato una significativa diminuzione dell'ipersensibilità meccanica 1 ora dopo l'iniezione per entrambe le dosi, ma solo un effetto significativo per la condizione di 5 mg/kg a 2 ore (*p < 0,05). (B) Le soglie di sospensione meccanica sono state confrontate tra la condizione salina e le due dosi di ibuprofene. Ripetute misure ANOVA a due vie con correzione Geisser-Greenhouse hanno rivelato un effetto significativo di 10 mg/kg di ibuprofene (F(1, 11) = 7,788, p = 0,0176, n = 6-7 per condizione) e un effetto significativo di 30 mg/kg di ibuprofene (F(1, 10) = 18,79, p = 0,0015, n = 6 per condizione). Il test di confronto multiplo di Sidak ha dimostrato una significativa diminuzione dell'ipersensibilità meccanica 1 e 2 ore dopo l'iniezione per entrambe le dosi (*p < 0,05). I dati sono presentati come media ± S.E.M. Abbreviazioni: pSNL = legatura parziale del nervo sciatico; IP = intraperitoneale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Strumenti chirurgici. Le due immagini illustrano i diversi strumenti utilizzati per l'intervento. (A) Portaaghi Castroviejo fine; (B) Portaaghi Castroviejo; (C) pinza Micro Adson; D) pinza Graefe extra fine; (E) gancio di vetro nervoso; (F) forbici sottili (11,5 cm); G) forbici sottili (9 cm); H) pinze per legatura; (I) pinza dell'iride. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Modello rappresentativo delle risposte di ritiro della zampa misurate dal test del filamento di von Frey. Per questa prova, il topo non ha risposto alle prime tre stimolazioni ma ha ritirato la zampa sulla quarta stimolazione con il filamento 4,56. Dopo la risposta positiva (x), è stato utilizzato un filamento più sottile (4.31), seguito da filamenti di dimensioni più piccole fino a quando il topo non ha risposto a un altro filamento (in questo caso, 4.08). Lo sperimentatore deve diminuire le dimensioni dei filamenti, uno per uno, fino a quando non ha una risposta (o). A seguito di un'assenza di risposta, lo sperimentatore ha utilizzato un filamento più spesso fino a ottenere una risposta positiva e ha diminuito le sue dimensioni in seguito alla risposta positiva (ottenuta qui con il filamento 4.31). Quattro stimoli sono stati condotti dopo la prima risposta positiva; lo schema cronologico di ogni stimolazione è annotato con numeri in rosso nel pannello A. In questo caso, i filamenti da 2,44 a 3,22 non sono mai stati utilizzati poiché l'animale non ha mostrato una risposta positiva con il filamento 3,61. (B) Lo schema delle risposte è stato poi compilato nel software Allodinia, riportato nello stesso ordine in cui i filamenti sono stati applicati (000xx0x0), nella casella evidenziata in bianco. La soglia risultante è stata quindi calcolata dal software (2.60839). Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S1: Scheda di raccolta dati per le prove di von Frey. Questa tabella consente agli sperimentatori di compilare schemi di risposte quando si utilizzano filamenti di von Frey. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il trattamento del dolore cronico richiede spesso farmaci a lungo termine, rendendo difficile la gestione del dolore. Pertanto, i modelli preclinici sono uno strumento essenziale per valutare i potenziali benefici di terapie innovative basate su approcci farmacologici o non farmacologici. I numerosi modelli di dolore neuropatico cronico comportano sfide a causa della maggiore variabilità delle tecniche chirurgiche tra i diversi ricercatori, portando a una ridotta riproducibilità. Pertanto, è essenziale caratterizzare i potenziali effetti antinocicettivi delle nuove terapie in più modelli ben caratterizzati e standardizzati.
Questo rapporto dimostra che la legatura parziale del nervo sciatico provoca lo sviluppo di dolore neuropatico cronico di lunga durata nei topi utilizzando metodi relativamente economici. pSNL esagera le risposte agli stimoli termici e meccanici e il modello risponde alla somministrazione di analgesici comunemente usati in modo dose-dipendente. Pertanto, il modello pSNL sembra essere un modello conveniente e sensibile per valutare i potenziali benefici di nuovi farmaci. Le caratteristiche primarie del dolore neuropatico sono l'iperalgesia e l'allodinia. Questo rapporto dimostra come l'allodinia meccanica e l'iperalgesia termica siano influenzate. Tuttavia, l'iperalgesia meccanica non è stata misurata. C'è una grande area grigia di sovrapposizione tra allodinia e iperalgesia. Entrambe le sensazioni rientrano sotto l'ombrello dell'ipersensibilità generale a uno stimolo sensoriale24. Pertanto, la sensazione stimolata potrebbe essere percepita come un'altra sensazione, come il calore come dolore freddo o il tatto come sensazione di bruciore. Pertanto, l'iperalgesia e l'allodinia sono spesso difficili da distinguere, specialmente nei modelli di dolore animale.
Il modello pSNL è stato utilizzato in più studi sul dolore cronico per valutare l'effetto dei composti analgesici, i meccanismi sottostanti del dolore cronico o anche l'impatto cognitivo del dolore neuropatico di lunga durata. La persistenza dell'ipersensibilità meccanica fino a 70 giorni consente lo studio degli effetti a lungo termine di nuovi farmaci25. È importante sottolineare che il periodo ottimale per i test comportamentali comprende la prima, la seconda e la terza settimana dopo l'intervento chirurgico, una volta stabilito il dolore cronico 8,11,26,27. Per valutare la potenza e l'efficacia di un farmaco o di una terapia non farmacologica, devono essere considerati trattamenti di controllo positivi come la morfina o l'ibuprofene, a seconda del disegno sperimentale. A differenza del test tail-flick, il test della piastra calda applica uno stimolo alla zampa che integra le vie sopraspinali19. Il test della piastra calda è stato ampiamente utilizzato per caratterizzare le proprietà antinocicettive dei farmaci in modelli di dolore neuropatico cronico in studi recenti 19,28,29,30,31,32,33.
Questo modello è stato utilizzato per caratterizzare nuovi trattamenti non oppioidi e identificare una nuova via del dolore che coinvolge il recettore della neurotensina di tipo 211,13. È stato anche usato per dimostrare il coinvolgimento delle modulazioni glicinergiche nel dolore cronico12 e lo sviluppo di nuove terapie e percorsi all'intersezione di sonno e dolore10. Tuttavia, fino ad oggi, nessun articolo ha presentato una spiegazione dettagliata dell'intervento chirurgico integrata da un video descrittivo.
Una critica comune al pSNL e modelli simili è l'affidabilità della coerenza del grado di danno causato dalla lesione del nervo neuropatico tra gli animali6. In questo articolo viene descritta una procedura per fondere e modellare manualmente un'asta di vetro per creare uno speciale gancio di vetro nervosa per risolvere questo problema. La maggior parte degli interventi chirurgici sugli animali utilizza una pinza per raccogliere nervi fini o vasi. Lo strumento di gancio del vetro nervosa consente un metodo più sicuro e meno soggetto a lesioni per gestire il nervo. Sebbene lo scopo di questo modello sia quello di creare lesioni nervose, è prudente evitare ulteriori danni al nervo diversi da quelli causati dalla sutura posizionata attraverso un terzo della larghezza del nervo sciatico. Il gancio di vetro del nervo è una superficie liscia e non dannosa su cui poggiare il nervo; Inoltre, la sfera / gancio all'estremità consente una facile raccolta e stabilizzazione. Inoltre, quando si sutura il nervo, la tecnica sopra descritta (sezione protocollo nota 5.7) raccomanda di tenere i fili in profondità all'interno della cavità corporea, più vicino a dove apparirà il nodo. Questo evita di tirare alla fine delle suture e favorisce l'applicazione di tensione sulla sutura più vicina al nervo quando si stringe il nodo. Questa tecnica previene ulteriori lesioni da allungamento se il nervo dovesse essere inavvertitamente estratto dal gancio del vetro nervoso, verso l'esterno della cavità nel processo di legare il nodo più stretto. Un ulteriore vantaggio è l'uso di forbici sottili per effettuare il taglio iniziale. Ciò consente un sito di incisione molto più piccolo e quindi una guarigione più rapida, al contrario dei tagli più grandi fatti con lame di bisturi.
Anche i metodi riportati in questo articolo presentano alcune limitazioni. Lo sviluppo del dolore cronico nel modello pSNL è influenzato dal sesso degli animali34. Pertanto, è essenziale che gli studi di ricerca includano entrambi i sessi nella loro analisi. Lo scopo di questo rapporto era quello di concentrarsi su una procedura chirurgica e non caratterizzava il dimorfismo sessuale del modello del dolore. Vale la pena ricordare che le misurazioni della sensibilità termica nei topi utilizzando il test di Hargreaves sono impegnative; Gli animali devono stare fermi in un piccolo recinto per alcuni secondi mentre viene applicato lo stimolo. Pertanto, abituare i topi alla custodia in plexiglass è un fattore chiave per ottenere risultati di successo. La misurazione del dolore evocato richiede anche un'attenta formazione dello sperimentatore. Si consigliano sia test comportamentali evocati che spontanei per valutare la sensibilità termica e meccanica, nonché la funzionalità dell'arto. Inoltre, in questo studio, la morfina e l'ibuprofene sono stati utilizzati come controlli positivi per l'effetto antinocicettivo. Questi due farmaci sono stati scelti in quanto sono comunemente usati come controlli positivi in più modelli di dolore e consentono un migliore confronto tra i diversi modelli. Tuttavia, è importante ricordare che pregabalin e gabapentin sono spesso prescritti per trattare il dolore neuropatico e gli studi incentrati sulla gestione del dolore neuropatico dovrebbero includere questi farmaci come controlli positivi.
Questo rapporto descrive con precisione un intervento chirurgico comunemente utilizzato per lo studio del dolore neuropatico cronico. Consentire ai ricercatori e ai tirocinanti di beneficiare di una descrizione visiva di questo modello murino faciliterà lo sviluppo di progetti di ricerca incentrati sulla comprensione dei meccanismi del dolore cronico o volti alla caratterizzazione di terapie innovative. Inoltre, l'uso di più modelli di dolore è essenziale per migliorare la riproducibilità e questo rapporto faciliterà l'implementazione del modello pSNL in nuovi laboratori.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da segnalare. Nessuno degli autori del manoscritto ha ricevuto alcun compenso o rimborso o onorario in alcun altro modo. Gli autori non sono affiliati con alcun fornitore o azienda farmaceutica associata a questo studio.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal National Center for Complementary and Integrative Health [R01AT009716, 2017] (M.M.I.), dal Comprehensive Chronic Pain and Addiction Center-University of Arizona (M.M.I.) e dal Medical Scientist Training Program (MSTP) presso l'Università dell'Arizona, College of Medicine, Tucson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5/0, FS-2, 30" Undyed PGA Braided Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Suture | CP Medical | 421A | https://cpmedical.com/suturesearch/product/421a-visorb-50-fs-2-30/ |
| 6/0, P-1, 18" Blue Polypropylene Monofilament Non-Absorbable Suture | CP Medical | 8697P | https://cpmedical.com/suturesearch/product/8697p-polypro-60-p-1-18/ |
| 9/0 (0.3 metric) Nylon Black Monofilament Suture | Crestpoint Ophthalmics | MANI 1407 | https://crestpointophthalmics.com/mani-1407-suture-trape-spatula-nylon-black-mono-box-of-12.html |
| Allodynia Software | National Instruments, LabView 2015 | Quantification of mean withdrawal thresholds (Von Frey data) | |
| C57Bl6/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000664 | https://www.jax.org/strain/000664 |
| Castroviejo needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Wound-Closure/Needle-Holders/Castroviejo-Needle-Holder/12565-14 |
| Cold Hot Plate Test | Bioseb | BIO-CHP | https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/563-cold-hot-plate-test.html |
| Elevated metal mesh stand for Von Frey | Bioseb | BIO-STD2-EVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1689-elevated-metal-mesh-stand-30-cm-height-to-fit-up-to-2-pvf-cages.html |
| Extra fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-curved-medium-point-general-purpose-forceps/16100110 |
| Fine Castroviejo needle holder | Simovision/Geuder | 17565 | https://simovision.com/assets/Uploads/Brochure-Geuder-Ophthalmic-Surgical-Instruments-EN2.pdf |
| Fine scissors (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14558-11 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-11 |
| Fine scissors (9 cm) | Fine Science Tools | 14558-09 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-09 |
| Iris forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Fine-Forceps/Iris-Forceps/11064-07 |
| Micro Adson forceps | Fine Science Tools | 392487 | https://www.fishersci.com/shop/products/micro-adson-tissue-forceps-1x2-teeth-german-steel/13820072#?keyword=adson%20forceps |
| Modular holder cages for rats and mice | Bioseb | BIO-PVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1206-modular-holder-cages-for-rats-and-mice.html |
| Moretti/Effetre #240 Light Cobalt Blue glass rods 4 mm | Ebay | N/A | https://www.ebay.com/itm/402389491328?hash=item5db0485e80:g:agYAAOS w9CtfnIVJ&amdata=enc %3AAQAHAAAAwCoqvgWRo NTe5Vq8PWOgfE4ygWeW4tL k81J1AFu%2Fkcbsk6pxYtJi6 digE5TL9SzlgMzYUMNDr%2B dku2%2B%2FEvB1qXqFmebE 020SGs9LPDXLL5w21un7jrM0 9xfWYvIzBYQYh6FRWyUJngC uuA9Bkjb9lxtZoYlg5y6PyFR2P 34xFk5xaNC5ib65M1%2Fr%2F 4w2Iw45QqsSyXH2cuUKRom0 AGBoBaIr%2BbJw1VnlMjGuc9dtx 4fbPbqoBNSWjj3RbZPOPTYS8Q %3D%3D%7Ctkp%3ABk9SR4q6- 6LfYA |
| Plantar Test for Thermal Stimulation - Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37570 | https://ugobasile.com/products/categories/pain-and-inflammation/plantar-test-for-thermal-stimulation |
| Touch-Test Sensory Evaluators, Set of 20 Monofilaments | North Coast Medical | NC12775-99 | https://www.ncmedical.com/products/touch-test-sensory-evaluators_1278.html |
| Tying forceps | Duckworth & Kent | 2-504ER8 | https://duckworth-and-kent.com/product/tying-forceps-9/ |
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