استخدام الفحص المجهري بفاصل زمني والاستنفاد النووي للبروتينات في مرحلة محددة لدراسة الانقسام الاختزالي في S. cerevisiae
Summary
يعد الفحص المجهري بفاصل زمني أداة قيمة لدراسة الانقسام الاختزالي في الخميرة الناشئة. يصف هذا البروتوكول طريقة تجمع بين تزامن دورة الخلية ، والفحص المجهري بفاصل زمني ، والاستنفاد الشرطي للبروتين المستهدف لتوضيح كيفية دراسة وظيفة بروتين معين أثناء فصل الكروموسوم الاختزالي.
Abstract
أحدث الفحص المجهري الفلوري ذو الفاصل الزمني ثورة في فهم أحداث دورة الخلية الاختزالية من خلال توفير بيانات زمنية ومكانية لا يمكن رؤيتها غالبا عن طريق تصوير الخلايا الثابتة. أثبتت الخميرة الناشئة أنها كائن نموذجي مهم لدراسة فصل الكروموسومات الميوزية لأن العديد من الجينات الاختزالية محفوظة بدرجة كبيرة. يسمح الفحص المجهري بفاصل زمني للانقسام الميوزي في الخميرة الناشئة بمراقبة الطفرات الاختزالية المختلفة لإظهار كيف تعطل الطفرة العمليات الاختزالية. ومع ذلك، تعمل العديد من البروتينات في نقاط متعددة في الانقسام الميوزي. وبالتالي ، فإن استخدام فقدان الوظيفة أو الطفرات الفارغة الاختزالية يمكن أن يعطل عملية مبكرة ، مما يعرقل أو يزعج العملية اللاحقة ويجعل من الصعب تحديد الأنماط الظاهرية المرتبطة بكل دور فردي. للتحايل على هذا التحدي ، يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استنفاد البروتينات بشكل مشروط من النواة في مراحل محددة من الانقسام الاختزالي أثناء مراقبة الأحداث الاختزالية باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني. على وجه التحديد ، يصف هذا البروتوكول كيفية مزامنة الخلايا في الطور التمهيدي الأول ، وكيف يتم استخدام تقنية المرساة بعيدا لاستنفاد البروتينات من النواة في مراحل اختزالية محددة ، وكيف يتم استخدام التصوير بفاصل زمني لمراقبة فصل الكروموسوم الميوتي. كمثال على فائدة هذه التقنية ، تم استنفاد بروتين كينيتوكور Ctf19 من النواة في نقاط زمنية مختلفة أثناء الانقسام الاختزالي ، وتم تحليل عدد كتل الكروماتين في نهاية الانقسام الاختزالي الثاني. بشكل عام ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لاستنفاد البروتينات النووية المختلفة من النواة أثناء مراقبة الانقسامات الاختزالية.
Introduction
تعد النسخة المجهرية الفلورية ذات الفاصل الزمني أداة قيمة لدراسة ديناميكيات فصل الكروموسوم الاختزالي في الخميرة الناشئة 1,2. يمكن حث خلايا الخميرة الناشئة على الخضوع للانقسام الميوزي من خلال تجويع العناصر الغذائية الرئيسية3. أثناء الانقسام الميوزي، تخضع الخلايا لجولة واحدة من فصل الكروموسومات يتبعها قسمان لتكوين أربعة نواتج اختزالية يتم تعبئتها في جراثيم (الشكل 1). يمكن تصور الخلايا الفردية خلال كل مرحلة من مراحل الانقسام الاختزالي ، والتي تولد بيانات مكانية وزمانية يمكن تفويتها بسهولة عن طريق التصوير بالخلايا الثابتة. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام الجمع بين الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني مع طريقتين تم تحديدهما مسبقا ، نظام NDT80 القابل للحث (NDT80-in) وتقنية المرساة بعيدا ، لدراسة وظيفة بروتينات معينة في مراحل اختزالية متميزة.
يعد نظام NDT80-in أداة قوية لمزامنة دورة الخلية الاختزالية التي تعتمد على التعبير المستحث لعامل نسخ الانقسام الاختزالي الأوسط NDT80 4,5. تعبير NDT80 مطلوب للخروجمن الطور الأول 6,7. مع نظام NDT80-in ، يكون NDT80 تحت سيطرة مروج GAL1-10 في الخلايا التي تعبر عن عامل النسخ Gal4 المنصهر في مستقبل هرمون الاستروجين (Gal4-ER) 4,5. نظرا لأن Gal4-ER يدخل النواة فقط عندما يرتبط ب β-استراديول ، فإن خلايا NDT80-in تتوقف في الطور التمهيدي الأول في غياب β-استراديول ، مما يسمح بمزامنة الخلايا في الطور التمهيدي الأول (الشكل 1). تعزز إضافة β-استراديول نقل عامل النسخ Gal4-ER إلى النواة ، حيث تربط GAL1-10 لدفع التعبير عن NDT80 ، مما يؤدي إلى الدخول المتزامن إلى الانقسامات الاختزالية. على الرغم من أنه يمكن إجراء الفحص المجهري بفاصل زمني دون تزامن ، إلا أن ميزة استخدام التزامن هي القدرة على إضافة مثبط أو دواء بينما تكون الخلايا في مرحلة معينة من الانقسام الاختزالي.
تقنية المرساة هي نظام قابل للتحريض يمكن من خلاله استنفاد البروتين من النواة مع إضافة رابامايسين8. هذه التقنية مثالية لدراسة البروتينات النووية أثناء الانقسام الخلوي في الخميرة الناشئة؛ لأن خلايا فطر الخميرة تخضع للانقسام الميتوزي المغلق والانقسام الميوزي، حيث لا يتفكك الغلاف النووي. علاوة على ذلك ، هذه التقنية مفيدة جدا للبروتينات التي لها وظائف متعددة خلال الانقسام الميوزي. على عكس عمليات الحذف أو الأليلات الطافرة أو الأليلات الفارغة الاختزالية ، فإن إزالة البروتين المستهدف من النواة في مرحلة معينة لا يضر بنشاط البروتين المستهدف في المراحل المبكرة ، مما يسمح بتفسير أكثر دقة للنتائج. يستخدم نظام المرساة بعيدا نقل الوحدات الفرعية الريبوسومية بين النواة والسيتوبلازم الذي يحدث عند نضوج الريبوسوم8. لاستنفاد البروتين المستهدف من النواة ، يتم تمييز البروتين المستهدف بمجال ربط FKBP12-rapamycin (FRB) في سلالة يتم فيها تمييز الوحدة الفرعية الريبوسومية Rpl13A ب FKBP12. بدون راباميسين ، لا يتفاعل FRB و FKBP12 ، ويبقى البروتين الموسوم ب FRB في النواة. عند إضافة rapamycin ، يشكل rapamycin مركبا مستقرا مع FKBP12 و FRB ، ويتم نقل المجمع خارج النواة بسبب التفاعل مع Rpl13A (الشكل 1). لمنع موت الخلايا عند إضافة رابامايسين ، تؤوي الخلايا طفرة TOR1-1 لجين TOR1 . بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي هذه الخلايا على fpr1Δ ، وهو أليل فارغ من بروتين S. cerevisiae FKBP12 ، والذي يمنع Fpr1 الداخلي من التفوق على Rpl13A-FKBP12 لربط FRB و rapamycin. لا تؤثر طفرات الخلفية البعيدة ، tor1-1 و fpr1Δ ، على التوقيت الاختزالي أو فصل الكروموسوم2.
لإثبات فائدة هذه التقنية ، تم استنفاد بروتين كينيتوخور Ctf19 في نقاط زمنية مختلفة طوال الانقسام الاختزالي. Ctf19 هو أحد مكونات الحركية التي يمكن الاستغناء عنها في الانقسام الميتوزي ولكنها مطلوبة لفصل الكروموسومات بشكل صحيح في الانقسام الميوزي9،10،11،12،13. في الانقسام الاختزالي ، يتم إلقاء الحركية في الطور التمهيدي الأول ، و Ctf19 مهم لإعادة تجميع الحركية 9,14. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تمت مزامنة الخلايا مع نظام NDT80-in ، وتم استخدام تقنية المرساة بعيدا لاستنفاد البروتين المستهدف Ctf19 من النواة قبل وبعد الإطلاق من الطور الأولي الأول ، وبعد فصل كروموسوم الانقسام الاختزالي الأول (الشكل 1). يمكن تكييف هذا البروتوكول لاستنفاد البروتينات الأخرى ذات الأهمية في أي مرحلة من مراحل الانقسام الميوزي والانقسام.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجمع هذا البروتوكول بين نظام NDT80-in لمزامنة الخلايا ، وتقنية المرساة بعيدا لاستنفاد البروتينات من النواة ، والفحص المجهري الفاصل الزمني الفلوري لتصوير خلايا الخميرة الناشئة أثناء الانقسام الاختزالي. نظام NDT80-in هو طريقة لمزامنة دورة الخلية الاختزالية التي تستخدم الطور الأولي للق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مركز التصوير المجهري الضوئي في جامعة إنديانا. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (GM105755).
Materials
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
