Использование покадровой микроскопии и стадийного ядерного истощения белков для изучения мейоза у S. cerevisiae
Summary
Покадровая микроскопия является ценным инструментом для изучения мейоза у почковых дрожжей. Этот протокол описывает метод, который сочетает в себе синхронизацию клеточного цикла, покадровую микроскопию и условное истощение целевого белка, чтобы продемонстрировать, как изучать функцию конкретного белка во время сегрегации мейотических хромосом.
Abstract
Покадровая флуоресцентная микроскопия произвела революцию в понимании событий мейотического клеточного цикла, предоставив временные и пространственные данные, которые часто не видны при визуализации фиксированных клеток. Почкование дрожжей оказалось важным модельным организмом для изучения сегрегации мейотических хромосом, потому что многие мейотические гены сильно сохраняются. Покадровая микроскопия мейоза у почковых дрожжей позволяет контролировать различные мейотические мутанты, чтобы показать, как мутация нарушает мейотические процессы. Тем не менее, многие белки функционируют в нескольких точках мейоза. Поэтому использование мутантов с потерей функции или мейотических нулевых мутантов может нарушить ранний процесс, блокируя или нарушая более поздний процесс и затрудняя определение фенотипов, связанных с каждой отдельной ролью. Чтобы обойти эту проблему, этот протокол описывает, как белки могут быть условно истощены из ядра на определенных стадиях мейоза при мониторинге мейотических событий с использованием покадровой микроскопии. В частности, этот протокол описывает, как клетки синхронизируются в профазе I, как метод удаления якоря используется для истощения белков из ядра на определенных мейотических стадиях и как покадровая визуализация используется для мониторинга сегрегации мейотических хромосом. В качестве примера полезности методики можно привести кинетохорный белок Ctf19 из ядра в разные моменты времени во время мейоза, а количество хроматиновых масс проанализировали в конце мейоза II. В целом, этот протокол может быть адаптирован для истощения различных ядерных белков из ядра при мониторинге мейотических делений.
Introduction
Покадровая флуоресцентная микроскопия является ценным инструментом для изучения динамики сегрегации мейотических хромосом у почковыхдрожжей 1,2. Почкование дрожжевых клеток может быть индуцировано подвергаться мейозу путем голодания ключевых питательных веществ3. Во время мейоза клетки подвергаются одному раунду сегрегации хромосом с последующим двумя делениями для создания четырех мейотических продуктов, которые упакованы в споры (рисунок 1). Отдельные клетки могут быть визуализированы на каждой стадии мейоза, что генерирует пространственные и временные данные, которые могут быть легко пропущены с помощью визуализации фиксированных клеток. Этот протокол показывает, как сочетание покадровой флуоресцентной микроскопии с двумя ранее установленными методами, индуцируемой системой NDT80 (NDT80-in) и методом якоря, может быть использовано для изучения функции специфических белков на различных мейотических стадиях.
Система NDT80-in является мощным инструментом для синхронизации мейотического клеточного цикла, который опирается на индуцируемую экспрессию фактора транскрипции среднего мейоза NDT80 4,5. Выражение NDT80 требуется для профазы I выхода 6,7. В системе NDT80-in NDT80 находится под контролем промотора GAL1-10 в клетках, экспрессирующих фактор транскрипции Gal4, слитый с рецептором эстрогена (Gal4-ER)4,5. Поскольку Gal4-ER попадает в ядро только при связывании с β-эстрадиолом, клетки NDT80-in останавливаются в профазе I при отсутствии β-эстрадиола, что позволяет синхронизировать клетки в профазе I (рисунок 1). β-эстрадиола способствует транслокации фактора транскрипции Gal4-ER в ядро, где он связывает GAL1-10 для стимуляции экспрессии NDT80, что приводит к синхронному проникновению в мейотические деления. Хотя покадровая микроскопия может быть выполнена без синхронизации, преимуществом использования синхронизации является возможность добавления ингибитора или лекарственного средства, пока клетки находятся на определенной стадии мейоза.
Метод удаления якоря представляет собой индуцируемую систему, с помощью которой белок может быть истощен из ядра с добавлением рапамицина8. Этот метод идеально подходит для изучения ядерных белков во время деления клеток в почковых дрожжах, поскольку дрожжевые клетки подвергаются закрытому митозу и мейозу, при которых ядерная оболочка не разрушается. Кроме того, этот метод очень полезен для белков, которые имеют несколько функций на протяжении всего мейоза. В отличие от делеций, мутантных аллелей или мейотических нулевых аллелей, удаление белка-мишени из ядра на определенной стадии не ставит под угрозу активность целевого белка на более ранних стадиях, что позволяет более точно интерпретировать результаты. Система якоря использует перемещение рибосомных субъединиц между ядром и цитоплазмой, которое происходит при рибосомном созревании8. Чтобы истощить целевой белок из ядра, целевой белок помечается FKBP12-рапамицин-связывающим доменом (FRB) в штамме, в котором рибосомная субъединица Rpl13A помечена FKBP12. Без рапамицина FRB и FKBP12 не взаимодействуют, и помеченный FRB белок остается в ядре. При добавлении рапамицина рапамицин образует стабильный комплекс с FKBP12 и FRB, и комплекс выводится из ядра за счет взаимодействия с Rpl13A (рисунок 1). Чтобы предотвратить гибель клеток при добавлении рапамицина, клетки содержат мутацию tor1-1 гена TOR1. Кроме того, эти клетки содержат fpr1Δ, нулевой аллель белка S. cerevisiae FKBP12, который не позволяет эндогенному Fpr1 превзойти конкурирующий Rpl13A-FKBP12 для FRB и связывания рапамицина. Фоновые мутации, tor1-1 и fpr1Δ, не влияют на мейотические сроки или сегрегацию хромосом2.
Чтобы продемонстрировать полезность этого метода, кинетохорный белок Ctf19 был истощен в разные моменты времени на протяжении всего мейоза. Ctf19 является компонентом кинетохора, который не нужен при митозе, но необходим для правильной сегрегации хромосом при мейозе 9,10,11,12,13. При мейозе кинетохора выделяется в профазе I, а Ctf19 важен для повторной сборки кинетохора 9,14. Для этого протокола клетки с системой NDT80-in были синхронизированы, и метод удаления якоря был использован для истощения целевого белка Ctf19 из ядра до и после высвобождения из профазы I и после сегрегации хромосом мейоза I (рисунок 1). Этот протокол может быть адаптирован для истощения других белков, представляющих интерес на любой стадии мейоза и митоза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол сочетает в себе систему NDT80-in для синхронизации клеток, технику якоря для истощения белков из ядра и флуоресцентную покадровую микроскопию для изображения появляющихся дрожжевых клеток во время мейоза. Система NDT80-in – это метод синхронизации мейотического клето?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Центр визуализации световой микроскопии в Университете Индианы. Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения (GM105755).
Materials
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
