שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae
Summary
מיקרוסקופיה בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר מיוזה בשמרים ניצנים. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשלבת סנכרון מחזור התא, מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ודלדול מותנה של חלבון מטרה כדי להדגים כיצד לחקור את תפקודו של חלבון מסוים במהלך הפרדת כרומוזומים מיוטיים.
Abstract
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר חוללה מהפכה בהבנת אירועי מחזור תאים מיוטיים על ידי מתן נתונים טמפורליים ומרחביים שלעתים קרובות אינם נראים על ידי הדמיה של תאים קבועים. שמרים ניצנים הוכיחו את עצמם כאורגניזם מודל חשוב לחקר הפרדת כרומוזומים מיוטיים מאחר שגנים מיוטיים רבים נשמרים מאוד. מיקרוסקופיה בהילוך מהיר של מיוזה בשמרים ניצנים מאפשרת ניטור של מוטציות מיוטיות שונות כדי להראות כיצד המוטציה משבשת תהליכים מיוטיים. עם זאת, חלבונים רבים מתפקדים בנקודות מרובות במיוזיס. השימוש במוטנטים ריקים של אובדן תפקוד או מיוטי יכול אפוא לשבש תהליך מוקדם, לחסום או להפריע לתהליך המאוחר יותר ולהקשות על קביעת הפנוטיפים הקשורים לכל תפקיד בנפרד. כדי לעקוף את האתגר הזה, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לרוקן את החלבונים מהגרעין בשלבים ספציפיים של מיוזה תוך ניטור אירועים מיוטיים באמצעות מיקרוסקופיה בהילוך מהיר. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד התאים מסונכרנים ב-prophase I, כיצד טכניקת ה-anchor away משמשת לדלדול חלבונים מהגרעין בשלבים מיוטיים ספציפיים, וכיצד נעשה שימוש בהדמיה בהילוך מהיר כדי לעקוב אחר הפרדת כרומוזומים מיוטיים. כדוגמה לתועלת הטכניקה, חלבון הקינטוצ’ור Ctf19 התרוקן מהגרעין בנקודות זמן שונות במהלך המיוזיס, ומספר מסות הכרומטין נותח בסוף המיוזה השנייה. באופן כללי, ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לרוקן חלבונים גרעיניים שונים מהגרעין תוך ניטור החטיבות המיוטיות.
Introduction
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר הדינמיקה של הפרדת כרומוזומים מיוטיים בשמרים ניצנים 1,2. ניתן לגרום לתאי שמרים ניצנים לעבור מיוזה באמצעות הרעבה של חומרים מזינים חיוניים3. במהלך מיוזה, תאים עוברים סבב אחד של הפרדת כרומוזומים ולאחר מכן שתי חטיבות כדי ליצור ארבעה תוצרים מיוטיים הארוזים בנבגים (איור 1). ניתן לדמיין תאים בודדים לאורך כל שלב של מיוזה, אשר מייצר נתונים מרחביים וזמניים שניתן לפספס בקלות על ידי הדמיה של תאים קבועים. פרוטוקול זה מראה כיצד ניתן להשתמש בשילוב של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר עם שתי שיטות שנקבעו בעבר, מערכת NDT80 (NDT80-in) וטכניקת ה-anchor away, כדי לחקור את תפקודם של חלבונים ספציפיים בשלבים מיוטיים שונים.
מערכת NDT80-in היא כלי רב עוצמה לסנכרון מחזור תא מיוטי המסתמך על הביטוי הבלתי ניתן להשראה של גורם שעתוק המיוזה האמצעי NDT80 4,5. ביטוי NDT80 נדרש עבור prophase I יציאה 6,7. עם מערכת NDT80-in, NDT80 נמצא תחת שליטתו של מקדם GAL1-10 בתאים המבטאים את גורם השעתוק Gal4 שהתמזג עם קולטן אסטרוגן (Gal4-ER)4,5. מאחר ש-Gal4-ER נכנס לגרעין רק כאשר הוא קשור ל-β-אסטרדיול, תאי NDT80-in נעצרים בפרופאזה I בהיעדר β-אסטרדיול, מה שמאפשר סנכרון של תאים בפרופאזה I (איור 1). תוספת β-אסטרדיול מקדמת את הטרנסלוקציה של גורם השעתוק Gal4-ER לתוך הגרעין, שם הוא קושר את GAL1-10 כדי להניע ביטוי של NDT80, מה שמוביל לכניסה סינכרונית לחטיבות המיוטיות. למרות שניתן לבצע מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ללא סנכרון, היתרון בשימוש בסנכרון הוא היכולת להוסיף מעכב או תרופה בזמן שהתאים נמצאים בשלב מסוים של מיוזה.
טכניקת ה-anchor away היא מערכת אינדוקטיבית, שבאמצעותה ניתן לרוקן חלבון מהגרעין בתוספת של רפמיצין8. טכניקה זו אידיאלית לחקר חלבונים גרעיניים במהלך חלוקת התא בשמרים ניצנים מכיוון שתאי שמרים עוברים מיטוזה סגורה ומיוזה, שבה מעטפת הגרעין אינה מתפרקת. יתר על כן, טכניקה זו שימושית מאוד עבור חלבונים שיש להם פונקציות מרובות לאורך מיוזה. שלא כמו במחיקות, אללים מוטנטיים או אללים ריקים מיוטיים, הסרת חלבון מטרה מהגרעין בשלב מסוים אינה פוגעת בפעילות חלבון המטרה בשלבים מוקדמים יותר, ומאפשרת פרשנות מדויקת יותר של התוצאות. מערכת ה-anchor away משתמשת בסגירה של תת-יחידות ריבוזומליות בין הגרעין לציטופלסמה המתרחשת עם ההבשלה הריבוזומלית8. כדי לרוקן את חלבון המטרה מהגרעין, חלבון המטרה מתויג עם תחום הקישור FKBP12-rapamycin (FRB) בזן שבו תת-היחידה הריבוזומלית Rpl13A מתויגת עם FKBP12. ללא רפמיצין, FRB ו- FKBP12 אינם מתקשרים, והחלבון המתויג FRB נשאר בגרעין. עם הוספת רפמיצין, הרפאמיצין יוצר קומפלקס יציב עם FKBP12 ו-FRB, והקומפלקס מועבר אל מחוץ לגרעין עקב האינטראקציה עם Rpl13A (איור 1). כדי למנוע מוות של תאים עם תוספת רפמיצין, התאים מכילים את המוטציה tor1-1 של הגן TOR1 . בנוסף, תאים אלה מכילים fpr1Δ , אלל ריק של החלבון S. cerevisiae FKBP12, אשר מונע Fpr1 אנדוגני מ Rpl13A-FKBP12 מתחרה עבור FRB ו rapamycin קשירת. העוגן הרחק מוטציות רקע, tor1-1 ו- fpr1Δ, אינן משפיעות על תזמונים מיוטיים או על הפרדת כרומוזומים2.
כדי להדגים את התועלת של טכניקה זו, חלבון הקינטוצ’ור Ctf19 התרוקן בנקודות זמן שונות במהלך המיוזיס. Ctf19 הוא מרכיב של קינטוצ’ור הניתן לחלוקה במיטוזה אך נדרש להפרדה תקינה של כרומוזומים במיוזה 9,10,11,12,13. במיוזיס, הקינטוצ’ור נשפך בפרופאזה I, ו- Ctf19 חשוב להרכבה מחדש של קינטוצ’ור 9,14. עבור פרוטוקול זה, תאים עם מערכת NDT80-in היו מסונכרנים, וטכניקת ה-anchor away שימשה כדי לרוקן את חלבון המטרה Ctf19 מהגרעין לפני ואחרי השחרור מ-prophase I, ואחרי הפרדת כרומוזומים של meiosis I (איור 1). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לרוקן חלבונים אחרים בעלי עניין בכל שלב של מיוזה ומיטוזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה משלב את מערכת NDT80-in לסנכרון תאים, את טכניקת ה-anchor away לרוקן חלבונים מהגרעין, ואת המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית בהילוך מהיר כדי לדמות תאי שמרים ניצנים במהלך מיוזה. מערכת NDT80-in היא שיטה לסנכרון מחזור תאים מיוטי המשתמשת בפרופאזה I לעצור ולשחרר 4,8.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרכז ההדמיה למיקרוסקופיית אור באוניברסיטת אינדיאנה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (GM105755).
Materials
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
