एस सेरेविसिया में अर्धसूत्रीविभाजन का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन की टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी और स्टेज-विशिष्ट परमाणु कमी का उपयोग
Summary
टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी नवोदित खमीर में अर्धसूत्रीविभाजन का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। यह प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करता है जो सेल-चक्र सिंक्रनाइज़ेशन, टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी और लक्ष्य प्रोटीन की सशर्त कमी को जोड़ती है ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि मियोटिक क्रोमोसोम अलगाव के दौरान एक विशिष्ट प्रोटीन के कार्य का अध्ययन कैसे किया जाए।
Abstract
टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ने अस्थायी और स्थानिक डेटा प्रदान करके मियोटिक सेल-चक्र घटनाओं की समझ में क्रांति ला दी है जो अक्सर इमेजिंग फिक्स्ड कोशिकाओं द्वारा नहीं देखी जाती है। नवोदित खमीर मियोटिक गुणसूत्र अलगाव का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव साबित हुआ है क्योंकि कई मिओटिक जीन अत्यधिक संरक्षित हैं। नवोदित खमीर में अर्धसूत्रीविभाजन की टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी विभिन्न मियोटिक उत्परिवर्ती की निगरानी की अनुमति देती है ताकि यह दिखाया जा सके कि उत्परिवर्तन मायोटिक प्रक्रियाओं को कैसे बाधित करता है। हालांकि, कई प्रोटीन अर्धसूत्रीविभाजन में कई बिंदुओं पर कार्य करते हैं। इसलिए लॉस-ऑफ-फंक्शन या मियोटिक नल उत्परिवर्ती का उपयोग एक प्रारंभिक प्रक्रिया को बाधित कर सकता है, बाद की प्रक्रिया को अवरुद्ध या परेशान कर सकता है और प्रत्येक व्यक्तिगत भूमिका से जुड़े फेनोटाइप को निर्धारित करना मुश्किल बना सकता है। इस चुनौती को दरकिनार करने के लिए, यह प्रोटोकॉल बताता है कि टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अर्धसूत्रीविभाजन के विशिष्ट चरणों में प्रोटीन को नाभिक से सशर्त रूप से कैसे समाप्त किया जा सकता है। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल बताता है कि प्रोफ़ेज़ I में कोशिकाओं को कैसे सिंक्रनाइज़ किया जाता है, विशिष्ट मिओटिक चरणों में नाभिक से प्रोटीन को कम करने के लिए एंकर दूर तकनीक का उपयोग कैसे किया जाता है, और मीओटिक क्रोमोसोम अलगाव की निगरानी के लिए टाइम-लैप्स इमेजिंग का उपयोग कैसे किया जाता है। तकनीक की उपयोगिता के एक उदाहरण के रूप में, अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर किनेटोकोर प्रोटीन सीटीएफ 19 नाभिक से समाप्त हो गया था, और अर्धसूत्रीविभाजन द्वितीय के अंत में क्रोमैटिन द्रव्यमान की संख्या का विश्लेषण किया गया था। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल को मायोटिक डिवीजनों की निगरानी करते हुए नाभिक से विभिन्न परमाणु प्रोटीन को कम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोकॉपी नवोदित खमीर 1,2 में मियोटिक गुणसूत्र अलगाव की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। नवोदित खमीर कोशिकाओं को प्रमुख पोषक तत्वों की भुखमरी के माध्यम से अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरने के लिए प्रेरित किया जा सकताहै। अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, कोशिकाएं क्रोमोसोम अलगाव के एक दौर से गुजरती हैं, जिसके बाद चार अर्धसूत्री उत्पादों को बनाने के लिए दो विभाजन होते हैं जिन्हें बीजाणुओं में पैक किया जाता है (चित्रा 1)। अर्धसूत्रीविभाजन के प्रत्येक चरण में व्यक्तिगत कोशिकाओं की कल्पना की जा सकती है, जो स्थानिक और लौकिक डेटा उत्पन्न करती है जिसे फिक्स्ड-सेल इमेजिंग द्वारा आसानी से याद किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे दो पहले से स्थापित तरीकों, इंड्यूसेबल एनडीएटी 80 सिस्टम (एनडीएटी 80-इन) और एंकर अवे तकनीक के साथ टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के संयोजन का उपयोग अलग-अलग मियोटिक चरणों में विशिष्ट प्रोटीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
NDT80-in प्रणाली मियोटिक सेल चक्र सिंक्रनाइज़ेशन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है जो मध्य अर्धसूत्रीविभाजन प्रतिलेखन कारक NDT80 4,5 की इंड्यूसेबल अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। प्रोफ़ेज़ I निकास 6,7 के लिए NDT80 अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। NDT80-in प्रणाली के साथ, NDT80 एक एस्ट्रोजन रिसेप्टर (Gal4-ER)4,5 से जुड़े Gal4 प्रतिलेखन कारक को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में GAL1-10 प्रमोटर के नियंत्रण में है। चूंकि गैल 4-ईआर केवल नाभिक में प्रवेश करता है जब β-एस्ट्राडियोल से बंधे होते हैं, एनडीटी 80-इन कोशिकाएं β-एस्ट्राडियोल की अनुपस्थिति में प्रोफ़ेज़ I में गिरफ्तार होती हैं, जो प्रोफ़ेज़ I में कोशिकाओं के सिंक्रनाइज़ेशन की अनुमति देती है (चित्रा 1)। β-एस्ट्राडियोल जोड़ नाभिक में गैल 4-ईआर प्रतिलेखन कारक के स्थानांतरण को बढ़ावा देता है, जहां यह एनडीटी 80 की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए जीएएल 1-10 को बांधता है, जिससे मियोटिक डिवीजनों में तुल्यकालिक प्रवेश होता है। यद्यपि टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी को सिंक्रनाइज़ेशन के बिना किया जा सकता है, सिंक्रनाइज़ेशन का उपयोग करने का लाभ एक अवरोधक या दवा जोड़ने की क्षमता है जबकि कोशिकाएं अर्धसूत्रीविभाजन के एक विशिष्ट चरण में होती हैं।
एंकर अवे तकनीक एक इंड्यूसेबल सिस्टम है जिसके द्वारा रैपामाइसिन8 के अतिरिक्त नाभिक से एक प्रोटीन को समाप्त किया जा सकता है। यह तकनीक नवोदित खमीर में कोशिका विभाजन के दौरान परमाणु प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए आदर्श है क्योंकि खमीर कोशिकाएं बंद माइटोसिस और अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरती हैं, जिसमें परमाणु लिफाफा टूटता नहीं है। इसके अलावा, यह तकनीक प्रोटीन के लिए बहुत उपयोगी है जिसमें अर्धसूत्रीविभाजन में कई कार्य होते हैं। विलोपन, उत्परिवर्ती एलील, या मियोटिक नल एलील्स के विपरीत, एक विशिष्ट चरण में नाभिक से एक लक्ष्य प्रोटीन को हटाने से पहले चरणों में लक्ष्य प्रोटीन गतिविधि से समझौता नहीं होता है, जिससे परिणामों की अधिक सटीक व्याख्या की अनुमति मिलती है। एंकर अवे सिस्टम नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच राइबोसोमल सबयूनिट्स के शटलिंग का उपयोग करता है जो राइबोसोमल परिपक्वता8 पर होता है। नाभिक से लक्ष्य प्रोटीन को कम करने के लिए, लक्ष्य प्रोटीन को एफकेबीपी 12-रेपामाइसिन-बाइंडिंग डोमेन (एफआरबी) के साथ टैग किया जाता है जिसमें राइबोसोमल सबयूनिट आरपीएल 13 ए को एफकेबीपी 12 के साथ टैग किया जाता है। रैपामाइसिन के बिना, एफआरबी और एफकेबीपी 12 बातचीत नहीं करते हैं, और एफआरबी-टैग किया गया प्रोटीन नाभिक में रहता है। रैपामाइसिन के अलावा, रैपामाइसिन एफकेबीपी 12 और एफआरबी के साथ एक स्थिर परिसर बनाता है, और आरपीएल 13 ए (चित्रा 1) के साथ बातचीत के कारण परिसर को नाभिक से बाहर निकाल दिया जाता है। रैपामाइसिन जोड़ पर कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए, कोशिकाएं टीओआर 1 जीन के टोर 1-1 उत्परिवर्तन को परेशान करती हैं। इसके अतिरिक्त, इन कोशिकाओं में एफपीआर 1 ए होता है, जो एस सेरेविसिया एफकेबीपी 12 प्रोटीन का एक शून्य एलील है, जो एफआरबी और रैपामाइसिन बाइंडिंग के लिए एंडोजेनस एफपीआर 1 को प्रतिस्पर्धी आरपीएल 13 ए-एफकेबीपी 12 से रोकता है। पृष्ठभूमि उत्परिवर्तन, टोर 1-1 और एफपीआर 1 ए को दूर करने वाले एंकर, मियोटिक समय या गुणसूत्र अलगाव2 को प्रभावित नहीं करते हैं।
इस तकनीक की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, किनेटोकोर प्रोटीन सीटीएफ 19 को अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर समाप्त कर दिया गया था। सीटीएफ 19 किनेटोकोर का एक घटक है जो माइटोसिस में अपरिहार्य है लेकिन अर्धसूत्रीविभाजन 9,10,11,12,13 में उचित गुणसूत्र पृथक्करण के लिए आवश्यक है। अर्धसूत्रीविभाजन में, किनेटोकोर को प्रोफ़ेज़ I में बहा दिया जाता है, और Ctf19 किनेटोकोररी-असेंबली 9,14 के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल के लिए, एनडीएटी 80-इन सिस्टम वाली कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ किया गया था, और प्रोफ़ेज़ I से रिलीज से पहले और बाद में नाभिक से लक्ष्य प्रोटीन सीटीएफ 19 को कम करने के लिए एंकर अवे तकनीक का उपयोग किया गया था, और अर्धसूत्रीविभाजन I क्रोमोसोम अलगाव के बाद (चित्रा 1)। इस प्रोटोकॉल को अर्धसूत्रीविभाजन और माइटोसिस के किसी भी चरण में रुचि के अन्य प्रोटीनों को कम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के लिए एनडीटी 80-इन सिस्टम को जोड़ता है, नाभिक से प्रोटीन को कम करने के लिए एंकर दूर तकनीक, और अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान नवोदित खमीर कोशिकाओं की छवि के लिए प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इंडियाना विश्वविद्यालय में लाइट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सेंटर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (जीएम 105755) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
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