Användning av time-lapse-mikroskopi och stegspecifik nukleär utarmning av proteiner för att studera meios i S. cerevisiae
Summary
Time-lapse mikroskopi är ett värdefullt verktyg för att studera meios i spirande jäst. Detta protokoll beskriver en metod som kombinerar cellcykelsynkronisering, time-lapse-mikroskopi och villkorlig utarmning av ett målprotein för att visa hur man studerar funktionen hos ett specifikt protein under meiotisk kromosomsegregering.
Abstract
Time-lapse fluorescensmikroskopi har revolutionerat förståelsen av meiotiska cellcykelhändelser genom att tillhandahålla tidsmässiga och rumsliga data som ofta inte ses genom avbildning av fasta celler. Spirande jäst har visat sig vara en viktig modellorganism för att studera meiotisk kromosomsegregering eftersom många meiotiska gener är mycket bevarade. Time-lapse-mikroskopi av meios i spirande jäst gör det möjligt att övervaka olika meiotiska mutanter för att visa hur mutationen stör meiotiska processer. Men många proteiner fungerar på flera punkter i meios. Användningen av funktionsförlust eller meiotiska nollmutanter kan därför störa en tidig process, blockera eller störa den senare processen och göra det svårt att bestämma de fenotyper som är associerade med varje enskild roll. För att kringgå denna utmaning beskriver detta protokoll hur proteinerna kan utarmas villkorligt från kärnan i specifika stadier av meios medan man övervakar meiotiska händelser med hjälp av time-lapse-mikroskopi. Specifikt beskriver detta protokoll hur cellerna synkroniseras i profas I, hur ankartekniken används för att tömma proteiner från kärnan i specifika meiotiska stadier och hur time-lapse-avbildning används för att övervaka meiotisk kromosomsegregering. Som ett exempel på användbarheten av tekniken utarmades kinetokoreproteinet Ctf19 från kärnan vid olika tidpunkter under meios, och antalet kromatinmassor analyserades i slutet av meios II. Sammantaget kan detta protokoll anpassas för att tömma olika kärnproteiner från kärnan samtidigt som de meiotiska uppdelningarna övervakas.
Introduction
Time-lapse fluorescensmikroskopi är ett värdefullt verktyg för att studera dynamiken i meiotisk kromosomsegregering i spirande jäst 1,2. Spirande jästceller kan induceras att genomgå meios genom svält av viktiga näringsämnen3. Under meios genomgår celler en omgång kromosomsegregering följt av två divisioner för att skapa fyra meiotiska produkter som förpackas i sporer (figur 1). Enskilda celler kan visualiseras under varje steg av meios, vilket genererar rumsliga och tidsmässiga data som lätt kan missas genom avbildning med fasta celler. Detta protokoll visar hur kombinationen av time-lapse fluorescensmikroskopi med två tidigare etablerade metoder, det inducerbara NDT80-systemet (NDT80-in) och anchor away-tekniken, kan användas för att studera funktionen hos specifika proteiner i distinkta meiotiska stadier.
NDT80-in-systemet är ett kraftfullt verktyg för meiotisk cellcykelsynkronisering som förlitar sig på det inducerbara uttrycket av den mellersta meiostranskriptionsfaktorn NDT80 4,5. NDT80-uttryck krävs för profas I-utgång 6,7. Med NDT80-in-systemet är NDT80 under kontroll av GAL1-10-promotorn i celler som uttrycker Gal4-transkriptionsfaktorn smält till en östrogenreceptor (Gal4-ER)4,5. Eftersom Gal4-ER endast kommer in i kärnan när den är bunden till β-östradiol, arresteras NDT80-in-celler i profas I i frånvaro av β-östradiol, vilket möjliggör synkronisering av celler i profas I (Figur 1). β-östradioladdition främjar translokationen av Gal4-ER-transkriptionsfaktorn till kärnan, där den binder GAL1-10 för att driva uttryck av NDT80, vilket leder till synkron inträde i de meiotiska divisionerna. Även om time-lapse-mikroskopi kan utföras utan synkronisering, är fördelen med att använda synkronisering möjligheten att lägga till en hämmare eller ett läkemedel medan celler befinner sig i ett specifikt stadium av meios.
Ankartekniken är ett inducerbart system genom vilket ett protein kan tömmas från kärnan med tillsats av rapamycin8. Denna teknik är idealisk för att studera kärnproteiner under celldelning i spirande jäst eftersom jästceller genomgår sluten mitos och meios, där kärnhöljet inte bryts ner. Dessutom är denna teknik mycket användbar för proteiner som har flera funktioner under meios. Till skillnad från för deletioner, mutanta alleler eller meiotiska nollalleler äventyrar avlägsnandet av ett målprotein från kärnan i ett specifikt skede inte målproteinaktiviteten i tidigare skeden, vilket möjliggör en mer exakt tolkning av resultaten. Ankaret bort systemet använder shuttling av ribosomala subenheter mellan kärnan och cytoplasman som uppstår vid ribosomal mognad8. För att tömma målproteinet från kärnan märks målproteinet med FKBP12-rapamycinbindande domän (FRB) i en stam där den ribosomala underenheten Rpl13A är märkt med FKBP12. Utan rapamycin interagerar inte FRB och FKBP12, och det FRB-märkta proteinet förblir i kärnan. Vid rapamycintillsats bildar rapamycinet ett stabilt komplex med FKBP12 och FRB, och komplexet skjutsas ut ur kärnan på grund av interaktionen med Rpl13A (Figur 1). För att förhindra celldöd vid rapamycintillsats har cellerna tor1-1-mutationen av TOR1-genen . Dessutom innehåller dessa celler fpr1Δ , en nollallel av S. cerevisiae FKBP12-proteinet, vilket förhindrar att endogen Fpr1 konkurrerar ut Rpl13A-FKBP12 för FRB- och rapamycinbindning. Ankaret bort bakgrundsmutationer, tor1-1 och fpr1Δ, påverkar inte meiotiska tidpunkter eller kromosomsegregering2.
För att demonstrera användbarheten av denna teknik utarmades kinetokoreproteinet Ctf19 vid olika tidpunkter under meios. Ctf19 är en komponent i kinetokor som är dispenserbar vid mitos men krävs för korrekt kromosomsegregering vid meios 9,10,11,12,13. Vid meios kastas kinetokoren i profas I, och Ctf19 är viktigt för kinetokore-återmontering 9,14. För detta protokoll synkroniserades celler med NDT80-in-systemet, och ankartekniken användes för att tömma målproteinet Ctf19 från kärnan före och efter frisättningen från profas I och efter meios I-kromosomsegregering (figur 1). Detta protokoll kan anpassas för att tömma andra proteiner av intresse vid varje stadium av meios och mitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll kombinerar NDT80-in-systemet för att synkronisera celler, ankartekniken för att tömma proteiner från kärnan och fluorescenstidsfördröjningsmikroskopi för att avbilda spirande jästceller under meios. NDT80-in-systemet är en metod för meiotisk cellcykelsynkronisering som använder en profas I-arrestering och frisättning 4,8. Även om enskilda celler kommer att variera något i hur mycket tid som spenderas i vart och ett…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Light Microscopy Imaging Center vid Indiana University. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (GM105755).
Materials
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
