Summary
Dit protocol bespreekt een aanpak voor het genereren van epitheliale organoïden uit primair normaal en tumor borstweefsel door middel van differentiële centrifugatie. Verder zijn instructies opgenomen voor driedimensionale kweek en immunofluorescente beeldvorming van ingebedde organoïden.
Abstract
Organoïden zijn een betrouwbare methode voor het modelleren van orgaanweefsel vanwege hun zelforganiserende eigenschappen en behoud van functie en architectuur na voortplanting uit primair weefsel of stamcellen. Deze methode van organoïde generatie ziet af van eencellige differentiatie door meerdere passages en gebruikt in plaats daarvan differentiële centrifugatie om borstepitheelorganoïden te isoleren van mechanisch en enzymatisch gedissocieerde weefsels. Dit protocol biedt een gestroomlijnde techniek voor het snel produceren van kleine en grote epitheliale organoïden uit zowel muis- als menselijk borstweefsel, naast technieken voor organoïde inbedding in collageen en kelder extracellulaire matrix. Bovendien worden instructies voor in-gel fixatie en immunofluorescente kleuring gegeven met als doel de organoïde morfologie en dichtheid te visualiseren. Deze methodologieën zijn geschikt voor talloze downstream-analyses, zoals co-kweek met immuuncellen en ex vivo metastasemodellering via collageeninvasietest. Deze analyses dienen om het gedrag van celcellen beter op te helderen en een vollediger begrip te creëren van interacties binnen de micro-omgeving van de tumor.
Introduction
Het vermogen om epitheelcellen in vitro te modelleren is de basis geweest van modern biomedisch onderzoek omdat het cellulaire kenmerken vastlegt die in vivo niet toegankelijk zijn. Het kweken van epitheelcellijnen in een tweedimensionaal vlak kan bijvoorbeeld een beoordeling geven van de moleculaire veranderingen die optreden in een epitheelcel tijdens proliferatie1. Bovendien is het meten van de dynamische regulatie tussen signalering en genexpressie beperkt in in vivo systemen2. In kankeronderzoek heeft kankerepitheelcellijnmodellering de identificatie mogelijk gemaakt van moleculaire aanjagers van ziekteprogressie en potentiële medicijndoelen3. Het kweken van kankerepitheelcellijnen op een tweedimensionaal vlak heeft echter beperkingen, omdat de meeste genetisch vereeuwigd en gemodificeerd zijn, vaak klonaal van aard, geselecteerd op hun vermogen om te groeien in niet-fysiologische omstandigheden, beperkt in hun beoordeling van driedimensionale (3D) tumorweefselarchitectuur, en micro-omgevingsinteracties niet adequaat modelleren binnen een realistische weefselomgeving4. Deze beperkingen zijn vooral duidelijk bij het modelleren van metastase, die in vivo verschillende verschillende biologische stadia omvat, waaronder invasie, verspreiding, circulatie en kolonisatie op de verre orgaanlocatie5.
Kankerepitheelorganoïden zijn ontwikkeld om de 3D-omgeving en het gedrag van tumoren beter samen te vatten 6,7,8. Organoïden werden voor het eerst ontwikkeld uit enkele LRG5+ intestinale cryptecellen en gedifferentieerd om de 3D-structuur van crypt-villuseenheden weer te geven die de hiërarchische structuur van de dunne darm in vitrohandhaafden 9. Deze aanpak maakte real-time visualisatie en karakterisering van zelforganiserende weefselarchitectuur onder homeostatische en stressomstandigheden mogelijk. Als een natuurlijke uitbreiding werden kankerepitheelorganoïden ontwikkeld om veel verschillende soorten kanker te modelleren, waaronder colorectale 10, pancreas 11, borst12, lever13, long14, hersenen15 en maagkanker16. Kankerepitheliale organoïden zijn gebruikt om kankerevolutie17,18 en gemetastaseerd spatiotemporale gedrag 19,20 te karakteriseren en tumorheterogeniteit 21 te ondervragen en chemotherapieënte testen 22. Kankerepitheelorganoïden zijn ook geïsoleerd en verzameld tijdens lopende klinische onderzoeken om de respons van patiënten op antikankermiddelen en bestralingstherapie ex vivo 8,23,24,25 te voorspellen. Bovendien kunnen systemen met kankerepitheelorganoïden worden gecombineerd met andere niet-kankercellen, zoals immuuncellen, om een uitgebreider model van de tumormicro-omgeving te vormen om interacties in realtime te visualiseren, te ontdekken hoe kankerepitheelcellen de fundamentele aard van cytotoxische effector-immuuncellen zoals natuurlijke killercellen veranderen en potentiële immunotherapieën en antilichaamafhankelijke cytotoxische activiteit te testen26, 27,28. Dit artikel demonstreert een methode voor het genereren van epitheliale organoïden zonder passaging en inbedding in collageen en kelder extracellulaire matrix (ECM). Daarnaast worden ook technieken voor downstream beeldvorming van geïsoleerde organoïden gedeeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het muizenweefsel dat in dit manuscript wordt gebruikt, is ethisch verzameld in overeenstemming met de voorschriften en richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas. Evenzo stemden alle patiënten in voorafgaand aan weefseldonatie onder toezicht van een Institutional Review Board (IRB) en werden de monsters gedeïdentificeerd.
OPMERKING: Dit protocol beschrijft de generatie van organoïden uit primair weefsel.
1. Nachtelijke bereiding van materialen
- Voor inbedding in de extracellulaire matrix van de kelder (BECM), ontdooi het BECM-aliquot door het bij 4 °C te laten.
2. Bereiding van collagenase en runderserumalbumine (BSA) coatingoplossing
- Bereid 2,64% BSA/PBS-coatingoplossing (BSA-oplossing): steriel filter 50 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 4,10 ml 30% BSA-oplossing met behulp van een 50 ml/0,2 μm filterkolf. Deze BSA-oplossing kan worden gefilterd en opnieuw worden gebruikt.
- Bereid collagenase-oplossing voor borstweefsel van muizen: steriel filter 27 ml basaalcelmedium, 1,5 ml foetaal runderserum (FBS), 30 μl 50 mg/ml gentamicine, 15 μl insuline van 10 mg/ml, 600 μl van 0,1 g/ml collagenase A en 600 μl van 0,1 g/ml trypsine met behulp van een filterkolf van 50 ml/0,2 μm. Wijs tussen 10 ml en 30 ml collagenase-oplossing per muis toe, afhankelijk van de weefselmassa.
- Bereid collagenase-oplossing voor menselijk borstweefsel: steriel filter 18 ml RPMI-1640, 200 μl 100x penicilline-streptomycine-oplossing (pen/strepto), 200 μl 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES) buffer, 1 ml FBS en 400 μl 0,1 g/ml collagenase A met behulp van een filterkolf van 50 ml/0,2 μm. Wijs tussen 10 ml en 20 ml per weefselmonster toe, afhankelijk van de weefselmassa.
3. Media voorbereiden
- Bereid organoïde media: Steriel filter basaalcelmedium met 1% pen/streptokokken en 1% insuline-transferrine-selenium (ITS) met behulp van een 50 ml/0,2 μm filterkolf. Om organoïde groeifactormedia te maken, voegt u de basisfibroblastgroeifactor (bFGF) toe aan een eindconcentratie van 2,5 nM.
- Bereid borstepitheelmedia voor: Om 100 ml borstepitheelmedia te maken, filtert u een hoog glucosegehalte gewoon basaal medium met 1 ml 100x glutaminesupplement, 1 ml pen / streptokokken, 1 ml 10 mM HEPES-buffer (7,3 pH), 250 μl 30% BSA-stam, 1 μl 1 mg / ml choleratoxinevoorraad, 1 ml 50 μg / ml hydrocortisonvoorraad in PBS, 50 μL van 10 mg/ml humane insuline-oplossing, 10 μL van 50 μg/ml epidermale groeifactor (EGF) en 1% FBS met behulp van een 150 ml/0,2 μm filterkolf. Bewaar de media bij 4 °C en gebruik ze maximaal 2 weken.
- Amfotericine wassen: Steriele filter PBS met 2% pen/streptokokken en 2% amfotericine B. Bewaren bij 4 °C.
4. Verzamelen en verteren van weefsel
- Borstweefsel van muizen
- Euthanaseer de muis door deze gedurende 2-5 minuten in een CO2-kamer te plaatsen en volg dan met cervicale dislocatie. Met de ventrale kant naar boven gericht, splay muisledematen en gebruik vier naalden van 19 G om de muis bij de poten vast te pinnen op een bord bedekt met een absorberende pad. Spray met 70% ethanol om de vacht glad te maken en de huid te ontsmetten. Veeg uitwerpselen weg met een gaasje of tissue.
- Begin net boven het anogenitale gebied, knip omhoog vanaf de middellijn met een chirurgische schaar en zorg ervoor dat u niet door het peritoneum prikt. Bij het bereiken van de kin, maak laterale sneden door beide sleutelbeenderen en achterpoten naar beneden en speld de huid van de muis strak op het bord om borstvetkussens bloot te leggen.
- Lokaliseer de inguinale borstvetkussentjes op wild-type muizen door de inguinale lymfeklier in de buurt van de achterpoten te identificeren. Lokaliseer de thoracale borstvetkussens op wild-type muizen als het dikkere, gevasculariseerde weefsel onder de voorste ledematen.
- Gebruik een tang om het borstvetkussen te verhogen. Vermijd het verzamelen van onderliggende spieren. Gebruik het stompe uiteinde van een scherp-stompe schaar en maak een zak onder het borstvetkussen, weg van de huid. Snijd het borstvetkussentje in één compleet stuk weg.
- Zodra borstvetkussentjes zijn verwijderd, spoelt u ze in PBS voordat u ze in een steriele weefselkweekschaal plaatst. Snel overbrengen naar een weefselkweekkap.
OPMERKING: Gebruik voor borsttumoren een wattenstaafje bevochtigd met PBS om de tumor voorzichtig van de huid weg te rollen. Zorg ervoor dat u donkere of zachte gebieden vermijdt, omdat donkere verkleuring wijst op necrose, die geen gezonde organoïden zal opleveren. - Hak de borsttumoren fijn met een # 10 of # 11 scalpel om weefsel los te maken totdat het een pasta-achtige consistentie bereikt. Breng het gehakte weefsel over in een conische buis met 10-30 ml collagenase-oplossing met behulp van een scalpel. Om ervoor te zorgen dat al het weefsel wordt verzameld, pipetteer 1 ml collagenase-oplossing op de weefselkweekplaat en terug in de conische buis.
OPMERKING: Om grotere organoïden te produceren, moet de mechanische spijsvertering worden geminimaliseerd, waardoor enkele kleine zichtbare stukjes weefsel intact blijven. Als alternatief kan weefsel bevroren worden opgeslagen voor latere organoïdepreparatie met minimaal verlies van levensvatbaarheid. Om dit te doen, wast u weefsel in een oplossing van PBS of basale celmedia + 1% FBS en hakt u vervolgens grof fijn om het oppervlak te vergroten (het weefsel in een of twee vaste stukken houden). Verplaats het weefsel naar een cryo-injectieflacon, bedekt met vriesmedia (90% FBS + 10% dimethylsulfoxide (DMSO)). Vries de injectieflacons een nacht in een vriescontainer met gecontroleerde snelheid in voordat u ze in vloeibare stikstof opslaat. - Plaats de conische buis in een benchtop-incubator van 37 °C bij 180 RPM totdat het weefsel draadachtig wordt en de collagenase-oplossing troebel wordt. Een grote weefselmassa (ongeveer 500-800 mg) van een tumor duurt bijvoorbeeld 30-60 minuten. Een kleinere weefselmassa (ongeveer 100-300 mg) van wild-type borstvet pads duurt ongeveer 20-30 minuten. Als u het niet zeker weet, controleer dan met tussenpozen van 5 minuten.
- Na incubatie, centrifugeer de conische buis gedurende 10 minuten bij 550 x g bij kamertemperatuur (RT).
- Zuig het supernatant voorzichtig uit de conische buis.
OPMERKING: Ga vooruit, bedek alle pipetpunten, serologische pipetten en conische buizen met BSA-oplossing om verlies van organoïden als gevolg van hechting aan plastic te voorkomen. - Voeg 8 ml basaalcelmedia en 80 μl DNase-oplossing [2 E/μL] toe aan de buis. Keer zachtjes om gedurende 1-3 minuten.
- Voeg 12 ml basaalcelmedia toe aan de buis en meng voorzichtig door te pipetteren of draai de buis 15 keer voorzichtig om te mengen.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 550 x g bij RT.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet vervolgens in 12 ml basaalcelmedia.
- Laat de zwaarste weefselfragmenten tot op de bodem bezinken. Verzamel het supernatant met een serologische pipet en breng over in een conische buis van 15 ml. Deze suspensie bevat epitheliale organoïden en stromale/immuuncellen.
- Menselijk borstweefsel
- Verwerk de menselijke borstweefselmonsters voor organoïden of bewaar ze binnen 24 uur na verzameling. Bewaar de monsters bij 4 °C in CO2-onafhankelijke media met 1% 100x antibioticum-antimycoticum.
- Breng het weefsel over in een weefselkweekplaat. Kantel de plaat en zuig de overtollige opslagmedia op en spoel het weefsel vervolgens af met 5 ml van de amfotericine B-was. Verwijder de amfotericine B-was onmiddellijk.
- Hak het weefselmonster fijn met een # 10 of # 11 scalpel om het weefsel los te maken totdat het een pasta-achtige consistentie bereikt. Breng het gehakte weefsel over in een conische buis met 10-30 ml collagenase-oplossing met behulp van een scalpel. Om ervoor te zorgen dat al het weefsel wordt verzameld, pipetteer 1 ml collagenase-oplossing op de weefselkweekplaat en keer terug naar de conische buis.
OPMERKING: Om grotere organoïden te produceren, moet de mechanische spijsvertering worden geminimaliseerd, waardoor enkele kleine zichtbare stukjes weefsel intact blijven. De startweefselmassa voor dit protocol varieerde tussen 100-250 mg. Als alternatief kan weefsel bevroren worden opgeslagen voor latere organoïdepreparatie met minimaal verlies van levensvatbaarheid na stap 4.2.2 in 90% FBS + 10% DMSO zoals hierboven. - Plaats de conische buis in een 37 °C benchtop schudincubator bij 180 RPM totdat het weefsel kleiner wordt en collagenase troebel wordt. Controleer het weefsel met tussenpozen van 5 minuten. Collagenase dissociatie van menselijke monsters duurt ongeveer 5-20 minuten.
- Draai na incubatie de conische buis gedurende 10 minuten bij 550 x g bij RT naar beneden.
- Zuig het supernatant voorzichtig uit de conische buis.
OPMERKING: Ga vooruit, bedek alle pipetpunten, serologische pipetten en conische buizen met BSA-oplossing om verlies van organoïden als gevolg van hechting aan plastic te voorkomen. - Voeg 4 ml basaalcelmedia en 40 μl DNase-oplossing [2 E/μL] toe aan de conische buis. Keer zachtjes om gedurende 3 minuten.
- Voeg 6 ml basaalcelmedia toe aan de buis en meng voorzichtig door te pipetteren of draai de conische buis 15 keer voorzichtig om te mengen.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 550 x g bij RT.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet vervolgens in 10 ml basaalcelmedia.
- Laat de zwaarste weefselfragmenten tot op de bodem bezinken. Verzamel het supernatant en breng het over in een conische buis van 15 ml. Deze suspensie bevat epitheliale organoïden en stromale/immuuncellen.
5. Differentiële centrifugatie
- Puls tot 550 x g gedurende 3-4 s bij RT, zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 10 ml basale celmedia. Herhaal deze stap nog drie keer (in totaal vier spins).
- Zorg er na elke centrifugatie voor dat de pellet steeds ondoorzichtiger wordt. Deze resterende pellet zal epitheliale organoïden zijn.
6. Kleine organoïden verzamelen
- Puls tot 80-100 x g gedurende 3 s bij RT. Verzamel het supernatant in een verse BSA-gecoate buis en pulseer vervolgens tot 550 x g gedurende 3 s bij RT om de kleine organoïden te pelleteren.
7. Inbedding van organoïden in BECM
- Aliquot geschikte suspensie van organoïden in microcentrifugebuizen volgens de organoïdendichtheid ten opzichte van de hoeveelheid BECM per put (tabel 1). Gebruik bijvoorbeeld 50-100 organoïden voor 20 μL BECM in één put van een plaat met 96 putten.
OPMERKING: De organoïdendichtheid kan worden geteld met behulp van de volgende formule: ((Gemiddeld aantal organoïden)/50 μL) x verdunningsfactor. - Voer alle stappen uit op ijs. Leg de ontdooide BECM op ijs in een weefselkweekkap. Plaats tijdens het voorbereiden van de kap alle pipetpunten op ijs om af te koelen.
- Centrifugeer de microcentrifugebuizen gedurende 10 minuten bij 300 x g bij RT. Gooi het supernatant uit de buizen. Verplaats de buizen met organoïde pellets naar ijs en voeg het juiste volume BECM toe aan elke microcentrifugebuis (tabel 1).
OPMERKING: Aangezien BECM stroperig is, voegt u extra volumes (ongeveer 10% -20% extra van het koepelvolume) van BECM toe om rekening te houden met het verlies in de pipetpunt. - Pipet voorzichtig op en neer om de organoïden in BECM te resuspenderen en zorg ervoor dat er geen bubbels worden geproduceerd.
- Pipet de BECM-hangende organoïden langzaam en voorzichtig op het platingoppervlak. Breng tijdens het pipetteren langzaam de pipet omhoog om een koepel te creëren. Vul alle lege putten met PBS om de luchtvochtigheid te behouden.
- Plaats de plaat gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C om de BECM te laten stollen en dek vervolgens af met het juiste volume media (tabel 1).
8. Inbedding van organoïden in collageen
- Voer alle stappen uit op ijs. Bereid de collageenoplossing door in opeenvolgende volgorde 375 μL 10x DMEM, 100 μL 1 N natriumhydroxide (NaOH) en 3 ml rattenstaartcollageen I-oplossing te combineren in een conische buis van 15 ml. Pipetmix, waarbij je ervoor zorgt dat er geen bubbels worden gemaakt. Titreer de oplossing tot een pH van 7,2-7,4 met kleine hoeveelheden (stappen van 1-3 μL) NaOH of 10x DMEM indien nodig.
- Bedek de bodem van de putjes met de minimale hoeveelheid collageen die nodig is om de bodem van de put volledig te bedekken. Een benadering is om een kleine hoeveelheid collageen te plaatsen en de plaat van links naar rechts te wiegen om te coaten. Laat de collageenondervloeren gedurende 30 min-2 uur op 37 °C instellen.
- Aliquoteer de juiste suspensie van organoïden in microcentrifugebuizen volgens de organoïdendichtheid ten opzichte van de hoeveelheid collageen per put (tabel 1). Plaats in een incubator van 37 °C.
- Bewaar de collageenoplossing bij 4 °C en controleer de polymerisatie door elke 10 minuten onder een microscoop te controleren op vezelvorming. Collageen bereikt de juiste polymerisatie tussen 30 min-2 uur.
OPMERKING: Een goede polymerisatie kan worden bepaald door de aanwezigheid van vezels die zich door de matrix vertakken. Ga onmiddellijk verder met stap 8.5 zodra een paar vezels in het gezichtsveld zijn waargenomen. - Centrifugeer de microcentrifugebuizen op 300 x g gedurende 10 minuten bij RT. Gooi het supernatant uit de buizen. Verplaats de organoïde pellets naar ijs en voeg het juiste volume collageen toe aan elke microcentrifugebuis (tabel 1).
OPMERKING: Aangezien collageen stroperig is, voegt u extra volumes toe (ongeveer 10% -20% extra van het koepelvolume) collageen om rekening te houden met het verlies in de pipetpunt. - Pipet voorzichtig op en neer om organoïden in collageen te resuspenderen en zorg ervoor dat er geen bubbels worden geproduceerd.
- Pipetteer de collageen-gesuspendeerde organoïden langzaam en voorzichtig op het platingoppervlak. Breng tijdens het pipetteren langzaam de pipet omhoog om een koepel te creëren. Vul alle lege putten met PBS om de luchtvochtigheid te behouden.
- Plaats de plaat gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C om collageen te laten stollen en dek vervolgens af met het juiste volume media (tabel 1).
- OPMERKING: Organoïden behouden de levensvatbaarheid in 3D-matrix gedurende maximaal 7 dagen. Als beeldvorming wordt gebruikt voor analyse, gaat u verder met stap 9 en 10.
9. Bevestiging van ingebedde organoïden
- Gebruik een pipet om alle media uit de putten te verwijderen zonder contact te maken met ECM-koepels.
- Fixeren met 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS-oplossing gedurende 5 minuten.
- Was twee tot drie keer door PBS op putjes aan te brengen nadat je ze op een langzaam bewegende shaker hebt geplaatst. Breng na het wassen verse PBS aan op de koepels en bewaar de plaat bij 4 °C.
10. Immunofluorescente kleuring van ingebedde organoïden
- Oplossingen voorbereiden voor immunofluorescente kleuring
- Permeabilisatiebuffer: Bereid een PBS-oplossing voor met 10% Triton X-100.
- Blokkeringsbuffer: Bereid een PBS-oplossing voor met 10% FBS en 0,2% Triton X-100.
- Antilichaamverdunningsbuffer: Bereid een PBS-oplossing met 2% FBS en 0,2% Triton X-100.
- Permeabilisatie en blokkering
- Pipetteer voldoende permeabilisatiebuffer om de ECM-koepels te bedekken. Incubeer gedurende 1 uur bij RT op een langzaam bewegende shaker.
- Verwijder de permeabilisatiebuffer met een pipet en breng gedurende 3 uur hetzelfde volume blokkeerbuffer aan.
- Incubatie van primaire antilichamen
- Verwijder de blokkeringsbuffer met een pipet en breng de antilichaamverdunningsbuffer aan die het primaire antilichaam bevat in door de fabrikant gespecificeerde concentraties. Incubeer het monster bij 4 °C gedurende 12-16 uur op een langzaam bewegende schudder.
- Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was de monsters drie keer gedurende 10 minuten met PBS bij RT op een langzaam bewegende schudder.
- Secundaire antilichaamincubatie en nucleaire kleuring
- Zuig de resterende PBS-was op en breng de antilichaamverdunningsbuffer met secundaire antilichamen aan in door de fabrikant gespecificeerde concentraties. Voeg bovendien DAPI of Hoechst (om kernen te labelen) of falloidine (om actine te labelen) toe aan de buffer in een verhouding van 1:250. Incubeer gedurende 2-4 uur bij RT op een langzaam bewegende shaker.
- Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en was monsters drie keer gedurende 10 minuten in PBS bij RT op een shaker. Bewaar de monsters in PBS bij 4 °C tot beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De afbeeldingen in figuur 1 geven een voorbeeld van wild-type en tumoreuze borst epitheliale organoïden uit menselijke en muis weefsels. Een illustratie in één oogopslag van de methode voor het isoleren van epitheliale organoïden door middel van differentiële centrifugatie wordt gegeven in de cartoonworkflow in figuur 1A, waaruit blijkt dat primaire weefsels van verschillende soorten op bijna identieke manieren kunnen worden verwerkt terwijl epitheelweefsel wordt verkregen zoals weergegeven in de brightfield-afbeeldingen (figuur 1B ). Bovendien zijn deze overeenkomsten in de weefselsamenstelling tussen soorten te zien in de immunofluorescente afbeeldingen van ingebedde organoïden in de extracellulaire matrix van de kelder of collageen in figuur 2A-D. De organoïde structuur kan worden gevisualiseerd door middel van membraan Tomaat (mTomato) -etikettering of falloidine kleuring van actine. Deze cijfers tonen ook de verwachte organoïde samenstelling en grootte met behulp van deze methode. Organoïden ingebed in collageenmatrix kunnen worden gebruikt voor een invasietest en worden geanalyseerd door de uitzetting van ranken te volgen die zich vertakken van de organoïde zelf, zoals te zien is in figuur 2C. Ten slotte toont hematoxyline en eosine (H &E) kleuring van paraffine-ingebedde organoïden aan dat organoïden dezelfde histologie van borstkanker behouden (figuur 2E).
Figuur 1: Workflow voor de epitheliale organoïde generatie met voorbeeld organoïden . (A) Schema van workflow voor organoïde generatie uit muis of menselijk weefsel zonder passaging. (B) Representatieve beelden van geïsoleerde epitheliale organoïden van WT-borstklieren van muizen, borsttumoren van muizen en menselijke borsttumoren in media na isolatie. Elke afbeelding werd afzonderlijk aangepast voor helderheid en contrast voor verbeterde visualisatie. Beelden werden genomen in brightfield op een omgekeerde epi-fluorescerende microscoop bij 10x vergroting. De schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. Borsttumoren werden geïsoleerd uit MMTV-PyMT-muizen; normaal borstweefsel werd geïsoleerd uit FVB-muizen. Muizen varieerden van 8-14 weken van de leeftijd van29. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beeldvorming van organoïden in de extracellulaire matrix. Elke afbeelding is afzonderlijk aangepast voor helderheid en contrast voor verbeterde visualisatie voor deze collectie. Voorafgaand aan de beeldvorming werden monsters gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Wild-type monsters werden gekleurd met falloidine 568 om het celmembraan te visualiseren en alle monsters werden gekleurd met Hoechst om kernen te visualiseren, met organoïde morfologie en dichtheid. Beelden werden gemaakt met een vergroting van 10x op een confocale microscoop en verder vergroot met een scanzoom van 3.003. De lasergolflengte die werd gebruikt om DAPI te detecteren was 405 nm met een vermogen van 5 en de lasergolflengte die werd gebruikt om falloidine te detecteren was 561,0 nm voor kanaal 3 met een vermogen van 0,5. De confocale pinhole-grootte werd gehandhaafd op 19.16 voor alle afbeeldingen. (A) Representatief brightfieldbeeld van de WT-organoïde van de borst van de muis ingebed in BECM op dag 0. (A') 1:250 Hoechst labeling kernen en (A'') 1:250 phalloidin labeling actine immunofluorescente beelden van A. Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. Normaal borstweefsel werd geïsoleerd uit FVB-muizen. Muizen varieerden van 8-12 weken oud. (B) Representatief brightfieldbeeld van de organoïde van de borsttumor van de muis ingebed in BECM op dag 0. (B') 1:250 Hoechst labeling nuclei en (B'') mTomato-labeled immunofluorescent image of B. Scale bar vertegenwoordigt 20 μm. Borsttumoren werden geïsoleerd uit MMTV-PyMT-muizen. Muizen varieerden van 12-14 weken oud. (C) Representatief brightfieldbeeld van muis borsttumor organoïde ingebed in collageen I op dag 3. De afbeelding stelt een organoïde voor die "invasieve" eigenschappen aantoont. (C') 1:250 Hoechst labeling nuclei en (C') mTomato-gelabeld immunofluorescent beeld van C. Scale bar vertegenwoordigt 20 μm. Borsttumoren werden geïsoleerd uit MMTV-PyMT-muizen. Muizen varieerden van 12-14 weken oud. (D) Representatief brightfieldbeeld van humane borsttumororganoïde ingebed in BECM op dag 0. D') Hoechst labeling nuclei en (D'') 1:250 Actine-targeting phalloidin-labeled immunofluorescent image of D. Scale bar vertegenwoordigt 20 μm. (E) Doorsnede afbeelding van een organoïde ingebed in BECM en gekleurd met H &E genomen bij 20x vergroting. Schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. H &E-kleuring werd uitgevoerd door de University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Kweekplaat | ECM dome Volume | Aanbevolen aantal organoïden | Mediavolume |
| 6-well plaat | 200 μL | 300 | 3 ml |
| 12-well plaat | 150 μL | 225 | 2 ml |
| 24-puts plaat | 100 μL | 150 | 1 ml |
| 48-well plaat | 40 μL | 60 | 300 μL |
| 96-well plaat | 20 μL | 30 | 150 μL |
Tabel 1: Aanbevolen volume van ECM-componenten voor koepels, dichtheid van organoïden en volume van media dat nodig is per put op verschillende kweekplaten.
| Probleem | Mogelijke oorzaak | Oplossing | |||
| ECM-koepels zijn ingestort. | De plaat werd geschud, het ECM-volume was te groot om de koepelvorm te behouden, of de koepels raakten de rand van de put, waardoor ze bleven plakken en vielen. | Vermijd het te krachtig verplaatsen van de plaat voordat de koepels zijn ingesteld, verminder het volume ECM dat wordt gebruikt voor de resuspensie van organoïden of wees heel voorzichtig met het pipetteren van de koepels in het midden van de plaat. | |||
| Er is weefsel dat niet op organoïden lijkt. | Spierweefsel of zenuw kan zijn verzameld tijdens het oogsten van het borstvetkussen. | Knip alleen weg wat duidelijk een borstvetkussen is. Vermijd het verwijderen van het weefsel dat stevig op de huid is gehecht. | |||
| Er zijn veel dode organoïden. | Necrotisch tumorweefsel werd geoogst. | Vermijd het verzamelen van het weefsel van tumoren die necrotisch, cystisch, overmatig zacht of donkerder van kleur zijn. Tumorweefsel moet stevig zijn. | |||
| Er zijn meer enkele cellen dan organoïden. | Weefsel werd te fijngehakt of de collagenasevertering duurde te lang. | Vermijd over-gehakt van het weefsel of verminder de collagenase incubatietijd. | |||
| Er zitten bubbels in ECM. | Resuspensie door pipetteren was te krachtig en uitwerpen tijdens het pipetteren van koepels was te snel. | Langzaam resuspendeert u de organoïden in de ECU en pipet ze langzaam in koepels. Als het probleem aanhoudt, vermijd dan om naar de tweede stop te gaan tijdens het pipetteren. | |||
| Er is geen invasie van organoïden in collageen. | Collageen was niet goed gepolymeriseerd of overgepolymeriseerd. | Suspendeer de organoïde in collageen niet totdat deze goed is gepolymeriseerd. Controleer elke 30 min. Als er geen polymerisatie zichtbaar is, resuspensie bij de markering van 2 uur en de plaat onmiddellijk. | |||
| Er zijn geen collageenvezels zichtbaar tijdens het kijken naar polymerisatie. | Microscoopinstellingen waren niet gunstig. | Pas het fasecontrast aan voor maximale duisternis en breng vervolgens de helderheid van de microscoop helemaal omhoog. Bovendien kan het verhogen van de vergroting het zicht verbeteren. | |||
| ECM-koepels zijn opgelost. | De fixatietijd was te lang of PFA werd niet grondig verwijderd uit de in de ECU ingebedde monsters. | Houd de fixatietijd van de ECM-koepels onder de 5 minuten en volg met vijf wasbeurten op een roterende shaker gedurende elk 5 minuten. | |||
Tabel 2: Tabel met mogelijke problemen, oorzaken en oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de literatuur zijn verschillende methoden beschreven om tumororganoïden te genereren. Dit protocol belicht een methode voor het genereren van tumororganoïden rechtstreeks uit de tumor zonder te passeren. Met behulp van deze methode zijn tumororganoïden binnen enkele uren na het starten van de procedure produceerbaar en genereren ze bijna 100% levensvatbare organoïden in vergelijking met 70% gerapporteerd in de literatuur31. Ter vergelijking: andere methoden vereisen seriële passaging van cellen in organoïden gedurende meerdere weken. Zo worden de downstream-toepassingen, zoals het bepalen en visualiseren van immuuncelinteracties met gematchte organoïde en immuunmonsters van dezelfde gastheer zonder de impact van langetermijncultuur, haalbaarder. Verder, zoals benadrukt in figuur 2C, kan het inbedden van tumororganoïden in verschillende extracellulaire matrices de identificatie van belangrijke fenotypen in de metastatische cascade mogelijk maken, zoals invasie uit de primaire tumor. Andere downstream-toepassingen omvatten fenotypische assays van vertakkende morfogenese32, invasie, verspreiding en kolonievorming33 om te beoordelen op verschillende epitheelcelgedragingen. Immuuninteracties kunnen ook functioneel en visueel worden vastgelegd met deze op organoïden gebaseerde testen. Verder kunnen gels worden opgelost om ingebedde cellen te isoleren voor downstream-analyse van genetisch en eiwitgehalte met behulp van standaard biochemische en op stroming gebaseerde testen. Ten slotte, omdat grote hoeveelheden organoïden snel kunnen worden gegenereerd uit tumorweefsel, kunnen deze testen worden geschaald voor screeningstoepassingen voor geneesmiddelen en integratie in klinische onderzoeksworkflows.
Er zijn verschillende belangrijke stappen die van cruciaal belang zijn voor dit protocol. Ten eerste is de hoeveelheid tijd die nodig is voor collagenasevertering afhankelijk van de weefselsamenstelling en de hoeveelheid weefsel die wordt verteerd. Bij het werken met kleinere stukjes weefsel, zoals chirurgische monsters van menselijke borsttumoren (gemiddeld 100-250 mg), is bijvoorbeeld een kortere verteringstijd vereist. Borsttumoren die van een muis worden geoogst, zijn echter veel groter (500-800 mg) en kunnen 30-60 minuten enzymatische spijsvertering vereisen. Ten tweede, om een maximale opbrengst van epitheliale organoïden te garanderen, is het ook belangrijk om alle pipetpunten en serologische pipetten te coaten met BSA om verlies door celhechting aan plastic te voorkomen. Ten derde is een korte differentiële centrifugatietijd cruciaal voor het elimineren van niet-epitheliale weefselcomponenten. Deze benadering maakt het mogelijk dat zwaardere epitheliale organoïden pelleteren, terwijl lichtere stromale en immuuncompartimenten in het supernatant blijven. Voor het maken van invasietests door organoïden in collageen in te bedden, is het van cruciaal belang om een goede polymerisatie van het collageen mogelijk te maken voordat organoïden worden ingesloten. Deze stap moet visueel worden gecontroleerd door de vorming van collageenvezels onder een lichtmicroscoop te bevestigen. Tot slot, voor de beste beeldvormingsresultaten, zorg ervoor dat u geen bubbels produceert bij het resuspenditueren van organoïden in ECM en plating. Bubbels zullen organoïden in de gel verdoezelen en beelden vervormen. Tabel 2 geeft een overzicht van mogelijke problemen die zijn ondervonden en oplossingen om deze uitdagingen het hoofd te bieden.
Bepaalde stappen in het protocol staan wijzigingen toe om de grootte van de gegenereerde organoïden aan te passen of de tijd te verkorten die nodig is om het protocol uit te voeren. Het verhogen van de duur van de mechanische verteringstijd kan bijvoorbeeld resulteren in een kortere collagenase-verteringstijd, kleinere organoïden en meer individuele cellen. Centrifugatie na collagenasevertering kan worden verkort tot 5 minuten als wordt gewerkt met een grote hoeveelheid tumorweefsel. Media die worden gebruikt voor het kweken en kweken van organoïden kunnen een dag van tevoren worden bereid om tijd te besparen tijdens de organoïde genererende stappen. Evenzo kan tumorweefsel tot 24 uur worden opgeslagen in geschikte media vóór de voorbereiding van organoïden. Als de tijd extreem beperkt is, omvat dit protocol het pauzeren van stappen door tumorweefsel in te vriezen op de dag van verzameling. Vervolgens kunnen deze bevroren weefsels worden gebruikt om op een later tijdstip levensvatbare organoïden te genereren. Ongeveer 90% van de organoïden afgeleid van het bevroren weefsel waren levensvatbaar, visueel bevestigd onder een lichtmicroscoop en met een trypanblauwe oplossing.
Er zijn enkele beperkingen aan dit protocol. Hoewel deze aanpak snel levensvatbare organoïden genereert, wordt de hoeveelheid gegenereerde organoïden beperkt door de hoeveelheid tumorweefsel. Deze beperking wordt vooral duidelijk bij het werken met klinische monsters waarin de hoeveelheid tumorweefsel minder of soms zelfs beperkt is tot een paar cellen. In die extreme gevallen waar slechts enkele cellen als uitgangsmateriaal kunnen worden teruggewonnen, kan passaging een betere optie zijn. Een andere beperking is de reductionistische benadering van deze methode. Verwijdering van stromale compartimenten zoals fibroblasten of endotheelcellen verrijken de epitheliale organoïde generatie. Deze celpopulaties zijn echter van cruciaal belang voor de functie van de tumor. Daarom beperkt hun verwijdering de interpretatie van tumorbiologie die uitsluitend is afgeleid van epitheliale organoïde modellen. Kortom, dit protocol biedt een aanpak voor het snel genereren van epitheliale organoïden voor onmiddellijk gebruik in downstream beeldvorming, functionele (inclusief immuuninteracties) en medicijnscreeningstoepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door financiering van METAvivor, de Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation en het NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. We erkennen de hulp van de University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, een gedeelde bron in het Simmons Comprehensive Cancer Center, die gedeeltelijk wordt ondersteund door het National Cancer Institute onder toekenningsnummer P30 CA142543. Speciale dank aan alle leden van het Chan Lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
- Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).
- Hanahan, D.
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C.
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
- Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).
