광간섭 단층촬영을 통한 쥐 맥락막의 흑색종 이식 및 평가
Summary
현재 프로토콜은 광간섭 단층촬영을 사용하여 쥐 맥락막에 흑색종의 이식 및 평가를 설명합니다.
Abstract
실험적 맥락막 흑색종 모델을 확립하는 것은 올바른 국소화에서 종양을 유도하는 능력 측면에서 어렵습니다. 또한, 생체 내에서 후방 맥락막 흑색종을 관찰하는 데 어려움이 있어 종양 위치 및 성장 평가를 실시간으로 제한합니다. 여기에 설명된 접근 방식은 다단계 맥락막 B16LS9 세포 주입 절차를 통해 마우스에서 맥락막 흑색종을 확립하는 기술을 최적화합니다. 마우스 포도막의 작은 치수에 정밀하게 주입할 수 있도록 전체 절차를 현미경으로 수행합니다. 첫째, 결막 복막 절제술은 눈의 등쪽 측두엽 영역에 형성됩니다. 그런 다음 노출된 공막을 통해 바늘을 삽입하여 맥락막하 공간으로 관을 만듭니다. 그런 다음 무딘 바늘을 관에 삽입하고 흑색 종 세포를 맥락막에 주입합니다. 주사 직후 비침습적 광간섭단층촬영(OCT) 영상을 사용하여 종양 위치와 진행 상황을 결정합니다. 망막 박리는 종양 부위 및 크기의 예측 인자로 평가됩니다. 제시된 방법은 마우스에서 맥락막 국소 흑색종의 재현 가능한 유도 및 종양 성장 평가의 라이브 이미징을 가능하게 합니다. 따라서 안내 종양을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
Introduction
포도막 흑색종(UM)은 성인에서 가장 흔한 안내 원발성 악성 종양입니다. 안구 흑색종의 약 90%는 포도막관 맥락막 부위의 멜라닌 세포에서 유래한다1. UM은 환자의 약 50%가 전이성 질환을 앓고 있으며, 간은 전이의 주요 부위로 추정되기 때문에 이환율과 사망률의 주요 원인이다2. 원발성 병변을 조기에 치료하면 전이 가능성을 줄일 수 있지만, 전이 형성을 예방하는 효과적인 치료법은 없다3.
포도막 흑색종의 표준 치료에는 시신경병증, 망막병증, 안구건조증 및 백내장으로 인한 시력 상실과 관련된 방사선 요법이 포함됩니다. 외과적 절제는 전형적으로 병변의 성장이 인식되고 특성화될 때까지 지연된다. 그러나, 이러한 지연은 전이성 질환 발병을 허용할 수 있다4. 어떤 경우에는 쓸데없는 적출이 필요합니다. 물론, 이 급진적인 시술은 시력을 손상시키고 극적인 미적 저하를 초래합니다.
포도막 흑색종을 연구하기 위한 실험 모델을 개발하는 데 많은 노력이 있었습니다. 이 악성 종양을 정확하게 평가할 수 있는 전임상 동물 모델은 포도막 흑색종에 대한 새로운 진단 및 치료 전략을 조사하는 데 중요합니다. 안구 흑색종의 실험 동물 모델은 주로 생쥐, 쥐 및 토끼의 종양 세포 접종을 기반으로 합니다 5,6. 마우스 모델은 빠른 번식률과 인간과의 높은 게놈 유사성으로 인해 비용 효율적이며 흑색종 연구에 널리 사용됩니다. 쥐 피부 흑색종 세포주 B16은 일반적으로 C57BL6 마우스를 접종하고 동계 종양을 유도하는 데 사용됩니다. 이 모델을 사용하여 포도막 흑색종을 유도할 때 종양이 있는 눈은 일반적으로 접종 후 7-14일 후에 적출해야 합니다. 또한, B16은 매우 침습적인 모델이다. 눈의 면역 특권 특성은 전이를 지원하며 전이는 일반적으로 종양 세포 접종 후 3-4주 후에 감지될 수 있습니다. 원래 B16 계통의 계대배양은 뚜렷한 전이적 특성을 나타낸다6. 예를 들어, 퀸즈 흑색종 계통은 전이율이 높습니다 7,8. B16LS9 세포주는 수지상 세포 형태를 가지며 모 피부 흑색종 계통 B16F1을 주사한 C57BL/6 마우스의 간 전이에서 유래되었습니다9. 눈의 후방 구획에 주입했을 때, 이들 세포는 조직학적으로 인간 포도막 흑색종과 유사하고 C57BL/6에서 간 특이적 전이를 형성하지만 Balb/C, 마우스10,11,12에서 간 특이적 전이를 형성하는 것으로 나타났습니다. 유전적으로, 세포는 간세포 성장 인자13에 대한 세포 수용체로서 작용하는 c-met 원발암유전자의 더 높은 발현을 특징으로 한다. 대조적으로, 부모 B16의 10번째 통로인 B16F10은 안구 내 접종 시 주로 폐로 전이된다14. B16F10과 B16LS9는 모두 색소가 있다12.
몇 가지 주요 과제는 쥐 포도막 흑색종 모델의 성공을 제한합니다. 첫째, 종양 세포 역류는 안구외 또는 결막하 흑색종을 유발할 수 있습니다. 둘째, 흑색종 세포의 안내 접종 후 종양 성장은 종종 매우 가변적이어서 치료 및 진행 상황을 평가하는 데 어려움을 겪습니다. 또 다른 주요 어려움은 생체 내에서 종양 성장을 추적하는 능력이 제한되어 있다는 것입니다. 루시페라아제 발현 종양과 같은 생체발광 영상화는 안구 종양 성장을 모니터링하기 위해 일반적으로 사용되지만15,16, 종양의 안구 내 위치에 대한 정보를 제공할 수 없다. 그러므로, 종양의 평가는 전형적으로 눈의 적출술 후에 수행된다10,17. 이것은 종양 진행 및 치료에 대한 반응을 광범위하게 특성화하는 능력을 크게 제한합니다. 포도막 흑색종 연구의 또 다른 주요 장애물은 색소 생쥐의 병변을 모니터링하는 데 어려움이 있다는 것입니다. 이러한 어려움을 극복하는 새로운 접근법은 동물 모델에서 포도막 흑색종 연구를 촉진하기 위해 필요합니다.
광간섭 단층촬영(OCT)은 고해상도로 눈의 여러 부분을 심층적으로 영상화할 수 있는 독특한 기능을 제공하며, 이는 초음파18,19를 포함한 다른 방법론과 비교할 수 없습니다. OCT 영상은 다양한 안구 질환을 연구하기 위해 동물 모델에서 사용되어 왔다20. 최근에, OCT 영상은 안구 내 종양 성장을 평가하기 위한 비침습적 수단으로서 입증되었다21. 여기에 설명된 프로토콜은 쥐 맥락막에 흑색종 세포를 이식하고 세포 접종 시 안구 내 종양 국소화 및 크기를 예측하기 위한 OCT의 활용을 묘사합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
포도막 흑색종은 새로운 치료법이 절실히 필요한 치명적인 질병입니다. 그러나, 포도막 흑색종 및 잠재적 치료법에 대한 연구는 포도막 흑색종 동물 모델 1,25의 기술적 과제에 의해 제한된다. 암세포의 안구 내 주입에 의해 유도되는 안구 종양은 마우스 눈의 크기가 작기 때문에 국소화와 크기 모두에서 매우 다양합니다. 이러한 가변성은 종양 진행의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Arie Marcovich를 위해 이스라엘 과학 재단(ISF)의 보조금 1304/20에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 조직학 분석을 위해 이스라엘 레호보트에 있는 카플란 메디컬 센터 병리학과의 Shahar Ish-Shalom과 Ady Yosipovich에게 감사드립니다.
Materials
| 10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
| 30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
| Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
| B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
| Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
| C57BL/6 female mice | Envigo | ||
| Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
| Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
| HEPES | satorius | 03-025-1B | |
| Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
| InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
| Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
| L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
| Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
| Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
| Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
| Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
| Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
| RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
| Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
| Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
| Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |
References
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