光干渉断層撮影 による マウス脈絡膜への黒色腫の移植と評価
Summary
本プロトコールは、光干渉断層撮影を利用したマウス脈絡膜における黒色腫の移植および評価を記載する。
Abstract
実験的脈絡膜黒色腫モデルを確立することは、正しい局在で腫瘍を誘導する能力の観点から困難である。さらに、 生体内で 後脈絡膜黒色腫を観察することが困難であるため、腫瘍の位置と成長評価がリアルタイムで制限されます。ここで説明するアプローチは、多段階脈絡膜下B16LS9細胞注入手順 を介して マウスに脈絡膜黒色腫を確立するための技術を最適化します。マウスのuveaの小さな寸法に正確に注入できるようにするために、完全な手順は顕微鏡下で実行されます。第一に、結膜腹膜切開術が眼の背側頭領域に形成される。次に、露出した強膜に針を挿入することにより、脈絡膜下腔への管が作成されます。これに続いて、鈍い針を管に挿入し、黒色腫細胞を脈絡膜に注入します。注射直後に、非侵襲的光干渉断層撮影(OCT)イメージングを利用して、腫瘍の位置と進行を決定します。網膜剥離は、腫瘍部位およびサイズの予測因子として評価される。提示された方法は、マウスにおける脈絡膜局在性黒色腫の再現性のある誘導および腫瘍増殖評価のライブイメージングを可能にする。このように、それは眼内腫瘍を研究するための貴重なツールを提供します。
Introduction
ブドウ膜黒色腫(UM)は、成人で最も頻度の高い眼内原発性悪性腫瘍です。眼の黒色腫の約90%は、ブドウ膜路の脈絡膜領域のメラノサイトに起因します1。UMは、患者の50%近くが転移性疾患を発症し、肝臓が転移の主要な部位であると推定されているため、罹患率と死亡率の主な原因です2。原発巣の早期治療は転移の可能性を減らす可能性がありますが、転移の形成を防ぐ効果的な治療法はありません3。
ブドウ膜黒色腫の標準治療には、視神経障害、網膜症、ドライアイ症候群、白内障による視力喪失を伴う照射療法が含まれます。外科的切除は通常、病変の成長が認識され特徴付けられるまで延期されます。しかし、そのような遅延は転移性疾患の発症を可能にする可能性がある4。場合によっては、無駄な除核が必要です。もちろん、この根本的な手順は視力を損ない、劇的な美的劣化をもたらします。
ブドウ膜黒色腫を研究するための実験モデルの開発に捧げられた多くの努力がありました。この悪性腫瘍の正確な評価を可能にする前臨床動物モデルは、ブドウ膜黒色腫の新しい診断および治療戦略を研究するための鍵となります。眼黒色腫の実験動物モデルは、主にマウス、ラット、およびウサギにおける腫瘍細胞の接種に基づいている5,6。マウスモデルは費用対効果が高く、繁殖速度が速く、ヒトとのゲノム類似性が高いため、黒色腫の研究に広く使用されています。マウス皮膚黒色腫細胞株B16は、C57BL6マウスに接種し、同系腫瘍を誘導するために一般的に利用されています。このモデルを使用してブドウ膜黒色腫を誘発する場合、腫瘍を持った眼は通常、接種後7〜14日で除核する必要があります。さらに、B16は非常に侵襲的なモデルです。眼の免疫特権の性質は転移をサポートし、転移は通常、腫瘍細胞接種後3〜4週間で検出される可能性があります。元のB16系統の継代培養は、明確な転移特性を示します6。例えば、クイーンズ黒色腫ラインは高い転移率7,8を有する。B16LS9細胞株は樹状細胞形態を有し、親皮膚黒色腫株B16F19を注射したC57BL/6マウスの肝転移に由来する。眼の後部コンパートメントに注射すると、これらの細胞は眼内腫瘍を形成し、組織学的にはヒトブドウ膜黒色腫に似ており、C57BL / 6では肝臓特異的転移を形成しますが、Balb / Cでは形成されません、マウス10、11、12。遺伝的には、細胞は、肝細胞増殖因子13の細胞受容体として作用するc-met癌原遺伝子のより高い発現によって特徴付けられる。対照的に、親B16の10回目の継代であるB16F10は、眼内接種すると主に肺に転移する14。B16F10とB16LS9の両方が12に着色されています。
いくつかの重要な課題が、マウスブドウ膜黒色腫モデルの成功を制限しています。第一に、腫瘍細胞の逆流は、眼外または結膜下黒色腫を引き起こし得る。第二に、メラノーマ細胞の眼内接種後の腫瘍増殖はしばしば非常に多様であり、治療と進行の評価が困難である。別の大きな困難は、in vivoで腫瘍の成長を追跡する能力が限られていることです。ルシフェラーゼ発現腫瘍などの生物発光イメージングは、眼腫瘍の成長を監視するために一般的に使用されていますが15,16、腫瘍の眼内位置に関する情報を提供することはできません。したがって、腫瘍の評価は、典型的には、眼10、17の除核に続いて行われる。これは、腫瘍の進行と治療への反応を広範囲に特徴付ける能力を大幅に制限します。ブドウ膜黒色腫を研究する際のもう一つの大きなハードルは、色素性マウスの病変を監視することの難しさです。これらの困難を克服する新しいアプローチは、動物モデルにおけるブドウ膜黒色腫の研究を促進するために求められています。
光干渉断層撮影(OCT)は、超音波を含む他の方法論では比類のない高解像度で目のさまざまなセクションの奥深くを画像化する独自の機能を提供します18,19。OCTイメージングは、様々な眼疾患を研究するために動物モデルで使用されています20。最近、OCTイメージングは、眼内腫瘍の成長を評価するための非侵襲的手段として実証された21。ここで説明するプロトコルは、マウス脈絡膜への黒色腫細胞の移植と、細胞接種時の眼内腫瘍の局在とサイズを予測するためのOCTの利用を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ブドウ膜黒色腫は壊滅的な病気であり、新しい治療アプローチが非常に必要とされています。しかし、ブドウ膜黒色腫と潜在的な治療法に関する研究は、ブドウ膜黒色腫動物モデルの技術的課題によって制限されています1,25。がん細胞の眼内注射によって誘発される眼腫瘍は、おそらくマウスの目の寸法が小さいため、局在とサイズの両方で非常?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、イスラエルのイスラエル科学財団(ISF)からのアリー・マルコビッチのための助成金1304/20によって部分的に支援されました。組織学分析のために、イスラエルのレホヴォトにあるカプラン医療センター病理学部のShahar Ish-ShalomとAdy Yosipovichに感謝します。
Materials
| 10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
| 30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
| Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
| B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
| Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
| C57BL/6 female mice | Envigo | ||
| Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
| Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
| HEPES | satorius | 03-025-1B | |
| Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
| InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
| Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
| L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
| Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
| Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
| Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
| Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
| Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
| RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
| Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
| Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
| Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |
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