Impianto e valutazione del melanoma nella coroide murina mediante tomografia a coerenza ottica
Summary
Il presente protocollo descrive l’impianto e la valutazione del melanoma nella coroide murina utilizzando la tomografia a coerenza ottica.
Abstract
Stabilire modelli sperimentali di melanoma coroideale è impegnativo in termini di capacità di indurre tumori alla corretta localizzazione. Inoltre, le difficoltà nell’osservazione del melanoma coroideale posteriore in vivo limitano la localizzazione del tumore e la valutazione della crescita in tempo reale. L’approccio qui descritto ottimizza le tecniche per stabilire il melanoma coroideale nei topi attraverso una procedura di iniezione di cellule sub-coroideali B16LS9 in più fasi. Per consentire la precisione nell’iniezione nelle piccole dimensioni dell’uvea del topo, la procedura completa viene eseguita al microscopio. In primo luogo, si forma una peritomia congiuntivale nell’area dorsale-temporale dell’occhio. Quindi, viene creato un tratto nello spazio sub-coroideale inserendo un ago attraverso la sclera esposta. Questo è seguito dall’inserimento di un ago smussato nel tratto e l’iniezione di cellule di melanoma nella coroide. Immediatamente dopo l’iniezione, viene utilizzata la tomografia a coerenza ottica non invasiva (OCT) per determinare la posizione e il progresso del tumore. Il distacco di retina viene valutato come predittore del sito e delle dimensioni del tumore. Il metodo presentato consente l’induzione riproducibile del melanoma localizzato dalla coroide nei topi e l’imaging dal vivo della valutazione della crescita tumorale. Come tale, fornisce uno strumento prezioso per lo studio dei tumori intraoculari.
Introduction
Il melanoma uveale (UM) è la neoplasia primaria intraoculare più frequente negli adulti. Circa il 90% dei melanomi oculari proviene da melanociti nella regione coroidea del tratto uveale1. La UM è una delle principali cause di morbilità e mortalità, poiché si stima che quasi il 50% dei pazienti sviluppi la malattia metastatica, con il fegato che è il sito principale delle metastasi2. Il trattamento precoce delle lesioni primarie può ridurre la possibilità di metastasi, ma nessun trattamento efficace previene la formazione di metastasi3.
Il trattamento standard del melanoma uveale comprende la terapia con irradiazione, che è associata alla perdita della vista a causa di neuropatia ottica, retinopatia, sindrome dell’occhio secco e cataratta. La resezione chirurgica è tipicamente ritardata fino a quando la crescita della lesione è riconosciuta e caratterizzata. Tuttavia, tale ritardo può consentire lo sviluppo di malattia metastatica4. In alcuni casi, è necessaria un’enucleazione futile. Naturalmente, questa procedura radicale compromette la visione e provoca un drammatico deterioramento estetico.
Ci sono stati molti sforzi dedicati allo sviluppo di modelli sperimentali per studiare il melanoma uveale. I modelli animali preclinici che consentono una valutazione accurata di questa neoplasia sono fondamentali per studiare nuove strategie diagnostiche e terapeutiche per il melanoma uveale. I modelli animali sperimentali di melanoma oculare si basano principalmente sull’inoculazione di cellule tumorali in topi, ratti e conigli 5,6. I modelli murini sono economici e ampiamente utilizzati per gli studi sul melanoma a causa del loro rapido tasso di riproduzione e dell’elevata somiglianza del genoma con gli esseri umani. La linea cellulare di melanoma cutaneo murino B16 è comunemente utilizzata per inoculare topi C57BL6 e indurre tumori singeneici. Quando si utilizza questo modello per indurre il melanoma uveale, gli occhi portatori di tumore in genere devono essere enucleati 7-14 giorni dopo l’inoculazione. Inoltre, B16 è un modello altamente invasivo. La natura immuno-privilegiata dell’occhio supporta le metastasi e le metastasi possono essere rilevate in genere 3-4 settimane dopo l’inoculazione delle cellule tumorali. Le sottoculture della linea B16 originale mostrano proprietà metastatiche distinte6. Ad esempio, la linea di melanoma Queens ha un alto tasso metastatico 7,8. La linea cellulare B16LS9 ha morfologia cellulare dendritica ed è stata derivata da metastasi epatiche di topi C57BL/6 iniettati con la linea di melanoma cutaneo parentale B16F19. Quando iniettate nel compartimento posteriore dell’occhio, queste cellule hanno dimostrato di formare tumori intraoculari, che istologicamente assomigliano al melanoma uveale umano e formano metastasi specifiche del fegato in C57BL / 6, ma non Balb / C, topi10,11,12. Geneticamente, le cellule sono caratterizzate da una maggiore espressione del proto-oncogene c-met, che agisce come recettore cellulare per il fattore di crescita degli epatociti13. Al contrario, B16F10, il decimopassaggio del B16 parentale, metastatizza principalmente ai polmoni quando inoculato per via intraoculare14. Sia B16F10 che B16LS9 sono pigmentati12.
Diverse sfide chiave limitano il successo dei modelli di melanoma uveale murino. In primo luogo, il reflusso delle cellule tumorali può portare al melanoma extraoculare o subcongiuntivale. In secondo luogo, la crescita tumorale dopo l’inoculazione intraoculare delle cellule di melanoma è spesso molto variabile, ponendo difficoltà nella valutazione del trattamento e dei progressi. Un’altra grande difficoltà è la limitata capacità di seguire la crescita tumorale in vivo. Mentre l’imaging bioluminescente, come i tumori che esprimono luciferasi, è comunemente usato per monitorare la crescita del tumore oculare15,16, non può fornire informazioni sulla posizione intraoculare del tumore. Pertanto, la valutazione del tumore viene tipicamente eseguita dopo l’enucleazione dell’occhio10,17. Ciò limita notevolmente la capacità di caratterizzare ampiamente la progressione del tumore e la risposta ai trattamenti. Un altro ostacolo importante nello studio del melanoma uveale è la difficoltà nel monitorare le lesioni nei topi pigmentati. Sono necessari nuovi approcci, che superino queste difficoltà, per promuovere la ricerca del melanoma uveale in modelli animali.
La tomografia a coerenza ottica (OCT) fornisce capacità distintive per l’immagine in profondità nelle diverse sezioni dell’occhio in alta risoluzione, che non ha eguali con altre metodologie, tra cui l’ecografia18,19. L’imaging OCT è stato utilizzato in modelli animali per studiare varie malattie oculari20. Recentemente, l’imaging OCT è stato dimostrato come mezzo non invasivo per valutare la crescita tumorale intraoculare21. Il protocollo qui descritto descrive l’impianto di cellule di melanoma nella coroide murina e l’utilizzo di OCT per prevedere la localizzazione e le dimensioni del tumore intraoculare al momento dell’inoculazione cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il melanoma uveale è una malattia devastante per la quale sono estremamente necessari nuovi approcci terapeutici. Tuttavia, la ricerca sul melanoma uveale e sui potenziali trattamenti è limitata dalle sfide tecniche dei modelli animali di melanoma uveale 1,25. I tumori oculari, che sono indotti dall’iniezione intraoculare di cellule tumorali, sono altamente variabili sia nella localizzazione che nelle dimensioni, probabilmente a causa delle piccole dimensioni d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione 1304/20 della Israel Science Foundation (ISF), Israele, per Arie Marcovich. Ringraziamo Shahar Ish-Shalom e Ady Yosipovich, del Dipartimento di Patologia, Kaplan Medical Center, Rehovot, Israele, per l’analisi istologica.
Materials
| 10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
| 30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
| Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
| B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
| Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
| C57BL/6 female mice | Envigo | ||
| Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
| Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
| HEPES | satorius | 03-025-1B | |
| Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
| InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
| Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
| L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
| Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
| Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
| Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
| Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
| Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
| RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
| Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
| Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
| Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |
References
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