माइकोप्लाज्मा निमोनिया का विशिष्ट पता लगाने के लिए एंटीजन-कैप्चर एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख
Summary
माइकोप्लाज्मा निमोनिया संक्रमण में, सीरोलॉजी परीक्षण अच्छे परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं, फिर भी प्रतिरक्षात्मक क्रॉस-रिएक्शन के कारण कम विशिष्टता के साथ। इस पेपर में वर्णित इन-हाउस एंटीजन-कैप्चर एलिसा, उच्च प्रजाति विशिष्टता की गारंटी देता है और एम निमोनिया के सटीक निदान के लिए एक विश्वसनीय स्क्रीनिंग टेस्ट दिखाया गया है।
Abstract
माइकोप्लाज्मा निमोनिया एक सेल दीवार की कमी वाला प्रोकैरियोट है, जो मुख्य रूप से मानव श्वसन पथ को उपनिवेशित करने और स्थानिक होने के लिए जाना जाता है, बड़े बच्चों और युवा वयस्कों में हर 6 साल में महामारी के चरम पर होता है। रोगज़नक़ की तीव्र प्रकृति और स्पर्शोन्मुख गाड़ी की संभावना के कारण एम निमोनिया का निदान चुनौतीपूर्ण है। रोगियों के सीरम नमूनों में एंटीबॉडी अनुमापन के आधार पर एम निमोनिया संक्रमण का प्रयोगशाला निदान सबसे अधिक प्रचलित विधि बनी हुई है। निमोनिया के लिए पॉलीक्लोनल सीरम के उपयोग के साथ इम्यूनोलॉजिकल क्रॉस-रिएक्टिविटी की संभावित समस्या के कारण, सीरोलॉजिकल निदान की विशिष्टता में सुधार के लिए एक एंटीजन-कैप्चर एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) विकसित किया गया है। एलिसा प्लेटों को एम. निमोनिया पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ लेपित किया जाता है, जो खरगोशों में उठाया जाता है और हेटरोलॉगस बैक्टीरिया के एक पैनल के खिलाफ सोखने के बाद विशिष्ट हो जाता है जो एम निमोनिया प्रजातियों के साथ एंटीजन साझा करते हैं और / या श्वसन पथ को उपनिवेशित करने के लिए जाने जाते हैं। निमोनिया होमोलोगस एंटीजन को विशेष रूप से सीरम नमूनों में उनके संबंधित एंटीबॉडी द्वारा पहचाना जाता है। भौतिक रासायनिक मापदंडों का आगे अनुकूलन जिसके लिए एंटीजन-कैप्चर एलिसा के अधीन है, एक अत्यधिक विशिष्ट, संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एलिसा का नेतृत्व करता है।
Introduction
माइकोप्लाज्मा सबसे छोटे और सबसे सरल ज्ञात प्रोकैरियोट्स में से हैं। वे मुख्य रूप से सेल की दीवार संरचना की कमी से अन्य बैक्टीरिया से अलग हैं। इस प्रकार, माइकोप्लाज्मा को मोलिक्यूट्स1 नामक एक अलग वर्ग में वर्गीकृत किया गया था। सेल की दीवार की कमी कुछ रोगाणुरोधी एजेंटों के खिलाफ इन सूक्ष्मजीवों के लिए आंतरिक प्रतिरोध प्रदान करती है और उनके बहुरूपता के लिए काफी हद तक जिम्मेदार है। माइकोप्लाज्मा में छोटे जीनोम और कम आकार होते हैं, जो उनकी चयापचय और जैव संश्लेषण क्षमताओं को सीमित करते हैं और उनके परजीवी और सैप्रोफाइटिक प्रकृतिकी व्याख्या करते हैं।
माइकोप्लाज्मा निमोनिया माइकोप्लाज़्मा में से एक है जो मनुष्य को संक्रमित करता है और इसे सबसे विषैलामाना जाता है। निमोनिया ऊपरी श्वसन पथ को उपनिवेशित करता है, जिससे बच्चों और युवा वयस्कों में एटिपिकल निमोनिया होता है। एम निमोनिया संक्रमण से उत्पन्न नैदानिक संकेत फ्लू जैसे होते हैं, सिरदर्द, बुखार और खांसीके साथ 3. मेजबान कोशिकाओं के लिए एम निमोनिया की साइटैडेंस को पी 1 प्रमुख आसंजन और कई सहायक प्रोटीन 4,5 सहित एक अनुलग्नक अंग द्वारा मध्यस्थ किया जाता है। स्थानीय सूजन और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली की उत्तेजना के कारण अधिक नैदानिक अभिव्यक्तियां हो सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप वायुमार्ग म्यूकोसा 6 के लिए एम निमोनिया का अंतरंग पालनहोता है। हालांकि निमोनिया एम निमोनिया संक्रमण की एक पहचान है, यह पता चला है कि इस जीवाणु के साथ संक्रमण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, हृदय, त्वचा और जोड़ों जैसे विभिन्न शारीरिक साइटों में गैर-फुफ्फुसीय अभिव्यक्तियों के एक विस्तृत स्पेक्ट्रम के लिए भी जिम्मेदार होसकता है।
सभी माइकोप्लाज्मा प्रजातियों के लिए, एम निमोनिया का निदान चुनौतीपूर्ण है। माइकोप्लास्मोसिस को जन्म देने वाले नैदानिक संकेत ज्यादातर अस्पष्ट और गैर-विशेषताहैं। चूंकि केवल नैदानिक अभिव्यक्तियों और लक्षणों पर भरोसा करके एम निमोनिया संक्रमण का निदान करना बहुत कठिन है, इसलिए प्रयोगशाला स्क्रीनिंगविशेष रुचि है। संस्कृति द्वारा एम निमोनिया कॉलोनियों का पता लगाना उचित निदान के लिए स्वर्ण मानक विधि है। हालांकि, तेजी से विकास की आवश्यकताएं और निश्चित परिणामों (1-2 सप्ताह) के वितरण के लिए आवश्यक लंबा समय संस्कृति को जटिल बनाता है, और इस प्रकार इसका मतलब है कि इसका उपयोग शायद ही कभीनियमित निदान के लिए किया जाता है। न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन प्रौद्योगिकियों को गति और दक्षता के संदर्भ में मान्य किया गया था, हालांकि कुछ स्वास्थ्य देखभाल सुविधाओं में उनकी अपेक्षाकृत उच्च लागत और अनुपलब्धता के कारण, इन आणविक तकनीकों को प्रथम-पंक्ति नैदानिक परीक्षण नहीं माना जाता है। यह सच है कि वाणिज्यिक पीसीआर परीक्षणों का व्यापक रूप से एम निमोनिया संक्रमण के निदान के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन वे अभी भी सीरोलॉजी को प्रतिस्थापित नहीं कर सकते हैं। इसके अलावा, झूठे नकारात्मक और झूठे सकारात्मक परिणामों दोनों की लगातार घटना ने पीसीआर9 के उपयोग को सीमित कर दिया है। नियमित रूप से, एम निमोनिया संक्रमण के निदान के लिए प्रयोगशालाओं में सीरोलॉजी सबसे अधिक प्रचलित है। दशकों से कई सीरोलॉजी दृष्टिकोणोंकी सूचना दी गई है, जैसे कि कोल्ड हेमग्लूटिनिन, पूरक निर्धारण परीक्षण11, अप्रत्यक्ष हेमग्लूटिनेशन टेस्ट12, इम्यूनोफ्लोरेसेंस13, और एलिसा की तकनीक, जिसे पहली बार 1980 के दशक की शुरुआत में माइकोप्लाज्मा सीरोलॉजी पर लागू किया गया था। निमोनिया संक्रमण के एलिसा सेरोडायग्नोसिस करते समय आने वाले प्रमुख मुद्दों में से एक क्रॉस-रिएक्शन है, जो तकनीक की विशिष्टता को काफी कम करता है। निमोनिया एंटीजन के साथ मानव सेरा के गैर-विशिष्ट सोखना पहले रिपोर्ट किया गया था; वास्तव में, मानव सेरा में एलिसा द्वारा पाए गए कई एंटीबॉडी हमेशा माइकोप्लाज्मल एंटीजन17 से बंधे नहीं हो सकते हैं, क्योंकि कुछ बैक्टीरिया18,19 और कुछ जानवरों और मानव ऊतकों 20 के साथ एम निमोनिया की समानता है।
प्रयोगशाला में अभ्यास किए गए पारंपरिक एलिसा परीक्षण में देखी गई उच्च पृष्ठभूमि रीडिंग के कारण, परिणामों की व्याख्या अक्सर जटिल थी, और इस प्रकार एक उचित एम निमोनिया निदान का वितरण एक कठिन काम था। इस मुद्दे का सामना करते हुए, हमने परीक्षण किए जाने वाले एंटीबॉडी के साथ एम निमोनिया एंटीजन की गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को हटाकर एम निमोनिया एलिसा में सुधार करने का विकल्प चुना। इस उद्देश्य के लिए, हमने सोखना तकनीक का उपयोग करके गैर-विशिष्ट एम निमोनिया एंटीजन की चयनात्मक कमी पर काम किया। वास्तव में, एंटीजन-कैप्चर एलिसा का मुख्य लक्ष्य विशेष रूप से मानव सीरम नमूनों में एम निमोनिया इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी) जी का पता लगाना है। इस एलिसा की अवधारणा में मुख्य रूप से मानव सीरम नमूनों को जोड़ने से पहले एम निमोनिया-विशिष्ट एंटीजन का चयनात्मक कब्जा शामिल है। इस चयनात्मकता का बीमा एम. निमोनिया पॉलीक्लोनल एंटीसेरम के साथ एम. निमोनिया क्रूड एंटीजन को इंजेक्ट करके किया जाता है, जो प्रयोगशाला में खरगोशों में उत्पादित होता है और इसे हेटरोलॉगस बैक्टीरिया के एक पैनल के खिलाफ सोखना द्वारा प्रजाति-विशिष्ट बनाता है, जो मोलिक्यूट्स वर्ग से संबंधित है या नहीं है, एम निमोनिया के साथ एंटीजन साझा करता है। प्रजातियां और / या श्वसन पथ को उपनिवेश ति करने के लिए जाना जाता है। सोखना प्रक्रिया को तीन बार दोहराया गया था, और क्रॉस-रिएक्टिविटी को खत्म करने के लिए इसकी दक्षता का परीक्षण इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा किया गया था। विकसित एलिसा परख सैंडविच और अप्रत्यक्ष एलिसा का एक संयोजन है। संक्षेप में, एलिसा प्लेट के कुओं को पहले एम निमोनिया के लिए विशिष्ट पॉलीक्लोनल एंटीसेरम के साथ लेपित किया जाता है। फिर, एम निमोनिया एंटीजन को जोड़ा जाता है और एंटीसेरम और सीरम नमूने में मौजूद एंटीबॉडी के बीच फंसाया जाता है। गठित इम्यूनोलॉजिकल कॉम्प्लेक्स का पता एक द्वितीयक एंजाइम-संयुग्मित एंटीबॉडी (पेरोक्सीडेज-संयुग्मित आईजीजी) द्वारा लगाया जाता है। प्रतिक्रियाओं को क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट के अतिरिक्त कल्पना की जाती है, और अवशोषण को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से मापा जाता है। यह इन-हाउस एलिसा योजनाबद्ध रूप से चित्रा 1 में प्रस्तुत किया गया है। होममेड एलिसा विशेष रूप से एम निमोनिया संक्रमण का पता लगाने में कुशल साबित हुआ और वर्तमान में नियमित नैदानिक गतिविधि में सबसे अधिक अभ्यास किए जाने वाले परीक्षणों में से एक है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर मुख्य रूप से विशिष्ट स्क्रीनिंग सुनिश्चित करने के लिए विकसित इन-हाउस एलिसा का एक सामान्य विवरण प्रस्तुत करता है M. pneumoniae इंफ़ेक्शन। एलिसा परख के प्रोटोकॉल के साथ-साथ कुछ पूर्व और बाद के प्रसंस…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को ट्यूनीशियाई स्वास्थ्य मंत्रालय और ट्यूनीशियाई उच्च शिक्षा और वैज्ञानिक अनुसंधान मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
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