Ensaio de imunoadsorção enzimática de captura de antígenos para detecção específica de Mycoplasma pneumoniae
Summary
Na infecção por Mycoplasma pneumoniae, os exames de sorologia podem gerar bons resultados, porém com baixa especificidade devido à reação cruzada imunológica. O ELISA interno de captura de antígenos, descrito neste artigo, garante alta especificidade de espécies e tem se mostrado um teste de triagem confiável para o diagnóstico preciso de M. pneumoniae.
Abstract
O Mycoplasma pneumoniae é um procariota deficiente em parede celular, conhecido principalmente por colonizar o trato respiratório humano e ser endêmico, com picos epidêmicos a cada 6 anos, em crianças mais velhas e adultos jovens. O diagnóstico de M. pneumoniae é um desafio devido à natureza fastidiosa do patógeno e à possibilidade de transporte assintomático. O diagnóstico laboratorial da infecção por M. pneumoniae com base na titulação de anticorpos nas amostras de soro dos pacientes continua sendo o método mais praticado. Devido ao potencial problema de reatividade cruzada imunológica com o uso de soro policlonal para M. pneumoniae, um ensaio imunoenzimático de captura de antígenos (ELISA) foi desenvolvido para melhorar a especificidade do diagnóstico sorológico. As placas ELISA são revestidas com anticorpos policlonais de M. pneumoniae, criadas em coelhos e tornadas específicas após adsorção contra um painel de bactérias heterólogas que compartilham antígenos com espécies de M. pneumoniae e/ou são conhecidas por colonizar o trato respiratório. Os antígenos homólogos de M. pneumoniae reagidos são então especificamente reconhecidos por seus anticorpos correspondentes nas amostras de soro. Uma otimização adicional dos parâmetros físico-químicos aos quais o ELISA de captura de antígeno é submetido levou a um ELISA altamente específico, sensível e reprodutível.
Introduction
Os micoplasmas estão entre os menores e mais simples procariontes conhecidos. Eles se distinguem principalmente de outras bactérias pela falta de uma estrutura de parede celular. Assim, os Mycoplasmas foram classificados em uma classe separada denominada Mollicutes1. A deficiência da parede celular confere resistência intrínseca a esses microrganismos contra alguns agentes antimicrobianos e é em grande parte responsável pelo seu polimorfismo. Os micoplasmas têm genoma pequeno e tamanho reduzido, o que limita suas capacidades metabólicas e biossintéticas e explica sua natureza parasitária e saprófita1.
O Mycoplasma pneumoniae é um dos Mycoplasmas que infectam o homem e acredita-se que seja o mais virulento2. M. pneumoniae coloniza o trato respiratório superior, levando a pneumonia atípica em crianças e adultos jovens. Os sinais clínicos engendrados pela infecção por M. pneumoniae são gripais, com cefaleia, febre e tosse3. A ciaderência de M. pneumoniae às células hospedeiras é mediada por uma organela de fixação que inclui a adesão maior de P1 e várias proteínas acessórias 4,5. Mais manifestações clínicas podem ocorrer devido à inflamação local e estimulação do sistema imunológico do hospedeiro resultante da adesão íntima de M. pneumoniae à mucosa das vias aéreas6. Embora a pneumonia seja uma característica da infecção por M. pneumoniae, tem sido revelado que a infecção por essa bactéria também pode ser responsável por um amplo espectro de manifestações não pulmonares em diferentes locais anatômicos, como sistema nervoso central, coração, pele e articulações7.
Como para todas as espécies de Mycoplasma, o diagnóstico de M. pneumoniae é desafiador. Os sinais clínicos que evocam micoplasmose são, em sua maioria, inaparentes e não característicos8. Como é muito difícil diagnosticar a infecção por M. pneumoniae baseando-se apenas em manifestações e sintomas clínicos, o rastreamento laboratorial é de particular interesse9. A detecção de colônias de M. pneumoniae por cultura é o método padrão-ouro para um diagnóstico adequado. No entanto, as necessidades de crescimento exigente e o longo tempo necessário para a entrega de resultados definitivos (1-2 semanas) complicam a cultura e, portanto, significam que ela raramente é usada para o diagnóstico de rotina10. As tecnologias de amplificação de ácido nucleico foram validadas em termos de velocidade e eficiência, embora devido ao seu custo relativamente alto e indisponibilidade em algumas unidades de saúde, essas técnicas moleculares não sejam consideradas testes diagnósticos de primeira linha. É verdade que os testes PCR comerciais são amplamente utilizados para diagnosticar infecções por M. pneumoniae, mas ainda não podem substituir a sorologia. Além disso, a ocorrência frequente de resultados falsos negativos e falsos positivos limitou o uso da PCR9. Rotineiramente, a sorologia continua sendo a mais praticada em laboratórios para o diagnóstico da infecção por M. pneumoniae. Várias abordagens sorológicas têm sido relatadas há décadas, como hemaglutininas frias, teste de fixação do complemento 11, teste de hemaglutinação indireta12, imunofluorescência 13 e a tecnologia ELISA, que foi aplicada pela primeira vez à sorologia para micoplasma no início da década de 198014,15,16. Um dos principais problemas encontrados ao realizar o sorodiagnóstico por ELISA da infecção por M. pneumoniae são as reações cruzadas, o que reduz consideravelmente a especificidade da técnica. A adsorção inespecífica de soros humanos com antígenos de M. pneumoniae foi previamente relatada; de fato, muitos dos anticorpos detectados pelo ELISA em soros humanos podem nem sempre estar ligados a antígenos micoplasmáticos 17, devido à semelhança de M. pneumoniae com algumas bactérias18,19 e alguns tecidos animais e humanos20.
Devido às altas leituras de fundo observadas no teste ELISA convencional que foi praticado em laboratório, a interpretação dos resultados foi muitas vezes complicada e, portanto, a entrega de um diagnóstico adequado de M. pneumoniae foi uma tarefa difícil. Ao enfrentar esse problema, optamos por melhorar o ELISA de M. pneumoniae removendo reações inespecíficas de antígenos de M. pneumoniae com anticorpos a serem testados . Para tanto, foi trabalhada a depleção seletiva dos antígenos inespecíficos de M. pneumoniae utilizando a técnica de adsorção. De fato, o principal objetivo do ELISA de captura de antígeno é detectar especificamente a imunoglobulina (Ig) G de M. pneumoniae em amostras de soro humano. O conceito deste ELISA consiste principalmente na captura seletiva de antígenos específicos de M. pneumoniae, antes da adição das amostras de soro humano. Esta seletividade é assegurada pela incubação do antígeno bruto de M. pneumoniae com um antissoro policlonal de M. pneumoniae, produzido em coelhos em laboratório e tornando-o espécie-específico por adsorção contra um painel de bactérias heterólogas, pertencentes ou não à classe Mollicus, compartilhando antígenos com M. pneumoniae espécies e/ou conhecidas por colonizar o trato respiratório. O procedimento de adsorção foi repetido três vezes, e sua eficiência para eliminar a reatividade cruzada foi testada por immunoblotting. O ensaio ELISA desenvolvido é uma combinação de sanduíche e ELISA indireto. Resumidamente, os poços da placa ELISA são primeiro revestidos com um antissoro policlonal específico para M. pneumoniae. Em seguida, o antígeno de M. pneumoniae é adicionado e preso entre o antissoro e os anticorpos presentes na amostra de soro a ser testada. O complexo imunológico formado é detectado por um anticorpo conjugado enzimático secundário (IgG conjugada com peroxidase). As reações são visualizadas pela adição de substrato cromogênico, e a absorbância é medida espectrofotometricamente. Esse ELISA interno é apresentado esquematicamente na Figura 1. O ELISA caseiro mostrou-se eficiente na detecção específica da infecção por M. pneumoniae e é atualmente um dos testes mais praticados na atividade diagnóstica de rotina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo apresenta uma descrição geral de um ELISA interno desenvolvido principalmente para garantir a triagem específica de M. pneumoniae Infeção. Os detalhes sobre o protocolo do ensaio ELISA em si, bem como algumas etapas de pré e pós-processamento são fornecidos. A especificidade deste ensaio é assegurada pela técnica de adsorção. Este procedimento foi previamente descrito em testes ELISA desenvolvidos para o diagnóstico de humanos e aves Mycoplasmas17,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado pelo Ministério da Saúde da Tunísia e pelo Ministério do Ensino Superior e Investigação Científica da Tunísia.
Materials
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
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