Bij Mycoplasma pneumoniae-infectie kunnen serologische tests goede resultaten opleveren, maar met een lage specificiteit vanwege immunologische kruisreactie. De in-house antigeenvangst ELISA, beschreven in dit artikel, garandeert een hoge soortspecificiteit en is een betrouwbare screeningstest gebleken voor een nauwkeurige diagnose van M. pneumoniae.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Antigeen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay voor specifieke detectie van Mycoplasma pneumoniae
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mycoplasma pneumoniae is een celwand-deficiënte prokaryoot, waarvan vooral bekend is dat het de menselijke luchtwegen koloniseert en endemisch is, met epidemische pieken om de 6 jaar, bij oudere kinderen en jonge volwassenen. De diagnose van M. pneumoniae is een uitdaging vanwege de kieskeurige aard van de ziekteverwekker en de mogelijkheid van asymptomatisch vervoer. Laboratoriumdiagnose van M. pneumoniae-infectie op basis van antilichaamtitratie in de serummonsters van patiënten blijft de meest beoefende methode. Vanwege het potentiële probleem van immunologische kruisreactiviteit met het gebruik van polyklonaal serum voor M. pneumoniae, is een antigeenvangst enzymgebonden immunosorbent assay (ELISA) ontwikkeld om de specificiteit van serologische diagnose te verbeteren. ELISA-platen zijn bedekt met M. pneumoniae polyklonale antilichamen, verhoogd bij konijnen en specifiek gemaakt na adsorptie tegen een panel van heterologe bacteriën die antigenen delen met M. pneumoniae-soorten en / of waarvan bekend is dat ze de luchtwegen koloniseren. De gereageerde M. pneumoniae homologe antigenen worden dan specifiek herkend aan hun overeenkomstige antilichamen in de serummonsters. Verdere optimalisatie van de fysisch-chemische parameters waaraan de antigeenvangst ELISA wordt onderworpen, leidde tot een zeer specifieke, gevoelige en reproduceerbare ELISA.
Inleiding
Mycoplasma's behoren tot de kleinste en eenvoudigste bekende prokaryoten. Ze onderscheiden zich vooral van andere bacteriën door het ontbreken van een celwandstructuur. Mycoplasma's werden dus ingedeeld in een aparte klasse genaamd Mollicutes1. De celwanddeficiëntie verleent intrinsieke resistentie tegen deze micro-organismen tegen sommige antimicrobiële middelen en is grotendeels verantwoordelijk voor hun polymorfisme. Mycoplasma's hebben een klein genoom en een kleinere omvang, wat hun metabole en biosynthetische mogelijkheden beperkt en hun parasitaire en saprofytische aard verklaart1.
<....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De huidige studie is uitgevoerd in overeenstemming met ethische aspecten die zijn vastgesteld door de ethische commissie van het Pasteur Instituut van Tunis.
1. Pre-ELISA stappen: Vereisten en voorbewerking
- Bacteriestammen en groeimedia
OPMERKING: Mollicutes soorten en de ommuurde bacteriën die in dit onderzoek worden gebruikt en hun groeimedia zijn opgenomen in tabel 1.- Groei van Mollicutes soorten
- Ent 200 μL uit de glycerolvoorraad van elke soort in 1.800 μL van de media.
- Kweek Mollicutes-soorten statisch bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 2-4 dagen totdat een....
- Groei van Mollicutes soorten
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De immunoblotting activiteit van de niet-geadsorbeerde polyklonale Mycoplasma pneumoniae antiserum aan heterologe bacteriën
Kruisreactiviteit bestaat inderdaad zoals aangetoond in de immunoblottingresultaten (figuur 2) en vergeleken met de positieve controle (Lane 1) worden sommige van de M. pneumoniae-antigenen gedeeld met de gescreende bacteriën. De intensiteit van deze kruisreacties was variabel. M. gallisepticum<.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel bevat een algemene beschrijving van een interne ELISA die voornamelijk is ontwikkeld om een specifieke screening van M. pneumoniae Infectie. De details over het protocol van de ELISA-test zelf en enkele voor- en nabewerkingsstappen worden verstrekt. De specificiteit van deze test wordt gewaarborgd door de adsorptietechniek. Deze procedure werd eerder beschreven in ELISA-tests die zijn ontwikkeld voor de diagnose van menselijke en aviaire Mycoplasmas17,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gefinancierd door het Tunesische ministerie van Volksgezondheid en het Tunesische ministerie van hoger onderwijs en wetenschappelijk onderzoek.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
Referenties
- Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
- Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
