Antigeen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay voor specifieke detectie van Mycoplasma pneumoniae
Summary
Bij Mycoplasma pneumoniae-infectie kunnen serologische tests goede resultaten opleveren, maar met een lage specificiteit vanwege immunologische kruisreactie. De in-house antigeenvangst ELISA, beschreven in dit artikel, garandeert een hoge soortspecificiteit en is een betrouwbare screeningstest gebleken voor een nauwkeurige diagnose van M. pneumoniae.
Abstract
Mycoplasma pneumoniae is een celwand-deficiënte prokaryoot, waarvan vooral bekend is dat het de menselijke luchtwegen koloniseert en endemisch is, met epidemische pieken om de 6 jaar, bij oudere kinderen en jonge volwassenen. De diagnose van M. pneumoniae is een uitdaging vanwege de kieskeurige aard van de ziekteverwekker en de mogelijkheid van asymptomatisch vervoer. Laboratoriumdiagnose van M. pneumoniae-infectie op basis van antilichaamtitratie in de serummonsters van patiënten blijft de meest beoefende methode. Vanwege het potentiële probleem van immunologische kruisreactiviteit met het gebruik van polyklonaal serum voor M. pneumoniae, is een antigeenvangst enzymgebonden immunosorbent assay (ELISA) ontwikkeld om de specificiteit van serologische diagnose te verbeteren. ELISA-platen zijn bedekt met M. pneumoniae polyklonale antilichamen, verhoogd bij konijnen en specifiek gemaakt na adsorptie tegen een panel van heterologe bacteriën die antigenen delen met M. pneumoniae-soorten en / of waarvan bekend is dat ze de luchtwegen koloniseren. De gereageerde M. pneumoniae homologe antigenen worden dan specifiek herkend aan hun overeenkomstige antilichamen in de serummonsters. Verdere optimalisatie van de fysisch-chemische parameters waaraan de antigeenvangst ELISA wordt onderworpen, leidde tot een zeer specifieke, gevoelige en reproduceerbare ELISA.
Introduction
Mycoplasma’s behoren tot de kleinste en eenvoudigste bekende prokaryoten. Ze onderscheiden zich vooral van andere bacteriën door het ontbreken van een celwandstructuur. Mycoplasma’s werden dus ingedeeld in een aparte klasse genaamd Mollicutes1. De celwanddeficiëntie verleent intrinsieke resistentie tegen deze micro-organismen tegen sommige antimicrobiële middelen en is grotendeels verantwoordelijk voor hun polymorfisme. Mycoplasma’s hebben een klein genoom en een kleinere omvang, wat hun metabole en biosynthetische mogelijkheden beperkt en hun parasitaire en saprofytische aard verklaart1.
Mycoplasma pneumoniae is een van de Mycoplasma’s die de mens infecteren en wordt beschouwd als de meest virulente2. M. pneumoniae koloniseert de bovenste luchtwegen, wat leidt tot atypische longontsteking bij kinderen en jonge volwassenen. De klinische symptomen veroorzaakt door M. pneumoniae-infectie zijn griepachtig, met hoofdpijn, koorts en hoest3. De cytadherentie van M. pneumoniae naar gastheercellen wordt gemedieerd door een hechtingsorganel inclusief P1 major adhesie en verschillende accessoire eiwitten 4,5. Meer klinische manifestaties kunnen optreden als gevolg van lokale ontsteking en stimulatie van het immuunsysteem van de gastheer als gevolg van de intieme therapietrouw van M. pneumoniae aan het luchtwegslijmvlies6. Hoewel longontsteking een kenmerk is van M. pneumoniae-infectie, is gebleken dat infectie met deze bacterie ook verantwoordelijk kan zijn voor een breed spectrum van niet-pulmonale manifestaties op verschillende anatomische plaatsen zoals het centrale zenuwstelsel, hart, huid en gewrichten7.
Zoals voor alle Mycoplasma-soorten is de diagnose van M. pneumoniae een uitdaging. De klinische symptomen die mycoplasmose oproepen zijn meestal onaangepast en niet-karakteristiek8. Aangezien het erg moeilijk is om M. pneumoniae-infectie te diagnosticeren door alleen te vertrouwen op klinische manifestaties en symptomen, is laboratoriumscreening van bijzonder belang9. Het opsporen van M. pneumoniae kolonies door kweek is de gouden standaard methode voor een juiste diagnose. De kieskeurige groeivereisten en de lange tijd die nodig is voor de levering van definitieve resultaten (1-2 weken) compliceren de cultuur echter en betekenen dus dat het zelden wordt gebruikt voor routinematige diagnose10. Nucleïnezuurversterkingstechnologieën werden gevalideerd in termen van snelheid en efficiëntie, hoewel vanwege hun relatief hoge kosten en onbeschikbaarheid in sommige zorginstellingen, deze moleculaire technieken niet worden beschouwd als eerstelijns diagnostische tests. Het is waar dat commerciële PCR-tests op grote schaal worden gebruikt om M. pneumoniae-infecties te diagnosticeren, maar ze kunnen de serologie nog steeds niet vervangen. Ook heeft het frequent voorkomen van zowel vals negatieve als vals-positieve resultaten het gebruik van PCR9 beperkt. Routinematig blijft serologie het meest beoefend in laboratoria voor de diagnose van M. pneumoniae-infectie. Verschillende serologische benaderingen worden al tientallen jaren gemeld, zoals koude hemagglutinines, complementfixatietest11, indirecte hemagglutinatietest12, immunofluorescentie13 en de technologie van ELISA, die voor het eerst werd toegepast op mycoplasma-serologie in de vroege jaren 1980 14,15,16. Een van de belangrijkste problemen bij het uitvoeren van ELISA-serodiagnose van M. pneumoniae-infectie is kruisreacties, wat de specificiteit van de techniek aanzienlijk verlaagt. Niet-specifieke adsorptie van menselijke sera met M. pneumoniae-antigenen werd eerder gemeld; in feite zijn veel van de antilichamen die door ELISA in menselijke sera worden gedetecteerd, mogelijk niet altijd gebonden aan mycoplasmale antigenen17, vanwege de gemeenschappelijkheid van M. pneumoniae met sommige bacteriën18,19 en sommige dierlijke en menselijke weefsels20.
Vanwege de hoge achtergrondmetingen die werden waargenomen in de conventionele ELISA-test die in het laboratorium werd geoefend, was de interpretatie van de resultaten vaak gecompliceerd en dus was de levering van een goede M. pneumoniae-diagnose een moeilijke opdracht. Terwijl we met dit probleem werden geconfronteerd, hebben we ervoor gekozen om de M. pneumoniae ELISA te verbeteren door niet-specifieke reacties van M. pneumoniae-antigenen met te testen antilichamen te verwijderen. Hiervoor werkten we aan selectieve depletie van de niet-specifieke M. pneumoniae-antigenen met behulp van de adsorptietechniek. In feite is het belangrijkste doel van de antigeenvangst ELISA om specifiek M. pneumoniae immunoglobuline (Ig) G te detecteren in menselijke serummonsters. Het concept van deze ELISA bestaat voornamelijk uit de selectieve vangst van M. pneumoniae-specifieke antigenen, alvorens de menselijke serummonsters toe te voegen. Deze selectiviteit is verzekerd door M. pneumoniae ruw antigeen te incuberen met een M. pneumoniae polyklonaal antiserum, geproduceerd bij konijnen in het laboratorium en het soortspecifiek te maken door adsorptie tegen een panel van heterologe bacteriën, al dan niet behorend tot de Mollicutes-klasse, die antigenen deelt met M. pneumoniae soorten en/of waarvan bekend is dat ze de luchtwegen koloniseren. De adsorptieprocedure werd driemaal herhaald en de efficiëntie ervan om kruisreactiviteit te elimineren werd getest door immunoblotting. De ontwikkelde ELISA-test is een combinatie van sandwich en indirecte ELISA. Kortom, de putten van de ELISA-plaat worden eerst bedekt met een polyklonaal antiserum dat specifiek is voor M. pneumoniae. Vervolgens wordt M. pneumoniae-antigeen toegevoegd en gevangen tussen het antiserum en de antilichamen die aanwezig zijn in het te testen serummonster. Het gevormde immunologische complex wordt gedetecteerd door een secundair enzymgeconjugeerd antilichaam (peroxidase-geconjugeerd IgG). De reacties worden gevisualiseerd door de toevoeging van chromogeen substraat en de absorptie wordt spectrofotometrisch gemeten. Deze interne ELISA is schematisch weergegeven in figuur 1. De zelfgemaakte ELISA bleek efficiënt te zijn in het specifiek detecteren van M. pneumoniae-infectie en is momenteel een van de meest beoefende tests in routinematige diagnostische activiteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel bevat een algemene beschrijving van een interne ELISA die voornamelijk is ontwikkeld om een specifieke screening van M. pneumoniae Infectie. De details over het protocol van de ELISA-test zelf en enkele voor- en nabewerkingsstappen worden verstrekt. De specificiteit van deze test wordt gewaarborgd door de adsorptietechniek. Deze procedure werd eerder beschreven in ELISA-tests die zijn ontwikkeld voor de diagnose van menselijke en aviaire Mycoplasmas17,<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door het Tunesische ministerie van Volksgezondheid en het Tunesische ministerie van hoger onderwijs en wetenschappelijk onderzoek.
Materials
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
References
- Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
- Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
- Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
- Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
- Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
- Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
- Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
- Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
- Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
- Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
- Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, 79-82 (1993).
- Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
- Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
- Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
- Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
- Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
- Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
- Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
- Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
- Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
- Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
- Fawcett, P. T., O’Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
- Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
- Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, 243-249 (1993).
- Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
- Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
- Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
- Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
- Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
- Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
- Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
- Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
