Antigen-fangst enzymbundet immunosorbentanalyse for spesifikk påvisning av Mycoplasma pneumoniae
Summary
Ved Mycoplasma pneumoniae-infeksjon kan serologitester gi gode resultater, men med lav spesifisitet på grunn av immunologisk kryssreaksjon. Den interne antigenfangsten ELISA, beskrevet i dette papiret, garanterer høy artsspesifisitet og har vist seg å være en pålitelig screeningstest for nøyaktig diagnose av M. pneumoniae.
Abstract
Mycoplasma pneumoniae er en cellevegg-mangelfull prokaryote, hovedsakelig kjent for å kolonisere den menneskelige luftveiene og å være endemisk, med epidemiske topper hvert 6. år, hos eldre barn og unge voksne. Diagnose av M. pneumoniae er utfordrende på grunn av patogenes raske natur og muligheten for asymptomatisk transport. Laboratoriediagnostikk av M. pneumoniae-infeksjon basert på antistofftitrering i serumprøver av pasienter er fortsatt den mest praktiserte metoden. På grunn av det potensielle problemet med immunologisk kryssreaktivitet ved bruk av polyklonalt serum for M. pneumoniae, er det utviklet en antigen-fangst enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) for å forbedre spesifisiteten til serologisk diagnose. ELISA-plater er belagt med M. pneumoniae polyklonale antistoffer, oppdratt hos kaniner og gjort spesifikke etter adsorpsjon mot et panel av heterologe bakterier som deler antigener med M. pneumoniae-arter og/eller er kjent for å kolonisere luftveiene. De reagerte M. pneumoniae homologe antigenene blir da spesifikt gjenkjent av deres tilsvarende antistoffer i serumprøvene. Ytterligere optimalisering av de fysisk-kjemiske parametrene som antigenfangsten ELISA blir utsatt for, førte til en svært spesifikk, sensitiv og reproduserbar ELISA.
Introduction
Mykoplasmer er blant de minste og enkleste kjente prokaryoter. De skiller seg hovedsakelig fra andre bakterier ved mangel på en celleveggstruktur. Dermed ble mykoplasmer klassifisert i en egen klasse kalt Mollicutes1. Celleveggmangelen gir iboende motstand mot disse mikroorganismer mot noen antimikrobielle midler og er i stor grad ansvarlig for deres polymorfisme. Mykoplasmer har lite genom og redusert størrelse, noe som begrenser deres metabolske og biosyntetiske evner og forklarer deres parasittiske og saprofytiske natur1.
Mycoplasma pneumoniae er en av mykoplasmaene som infiserer mennesket og antas å være den mest virulente2. M. pneumoniae koloniserer øvre luftveier, noe som fører til atypisk lungebetennelse hos barn og unge voksne. De kliniske tegnene som følge av M. pneumoniae-infeksjon er influensalignende, med hodepine, feber og hoste3. Cytadherensen av M. pneumoniae til vertsceller er mediert av en festeorganell inkludert P1 major-adhesjon og flere tilbehørsproteiner 4,5. Flere kliniske manifestasjoner kan oppstå på grunn av lokal betennelse og stimulering av vertsimmunsystemet som følge av intim tilslutning av M. pneumoniae til luftveisslimhinnen6. Selv om lungebetennelse er et kjennetegn på M. pneumoniae-infeksjon, har det blitt avslørt at infeksjon med denne bakterien også kan være ansvarlig for et bredt spekter av ikke-pulmonale manifestasjoner på forskjellige anatomiske steder som sentralnervesystemet, hjerte, hud og ledd.
Som for alle Mycoplasma-arter er diagnosen M. pneumoniae utfordrende. De kliniske tegnene som fremkaller mykoplasmose er for det meste inapparent og ikke-karakteristiske8. Siden det er svært vanskelig å diagnostisere M. pneumoniae-infeksjon ved bare å stole på kliniske manifestasjoner og symptomer, er laboratoriescreening av særlig interesse9. Å oppdage M. pneumoniae-kolonier etter kultur er gullstandardmetoden for en riktig diagnose. Imidlertid kompliserer de raske vekstkravene og den lange tiden som trengs for levering av endelige resultater (1-2 uker) kulturen, og betyr dermed at den sjelden brukes til rutinemessig diagnose10. Nukleinsyreforsterkningsteknologier ble validert når det gjelder hastighet og effektivitet, men på grunn av deres relativt høye kostnader og utilgjengelighet i enkelte helseinstitusjoner, betraktes disse molekylære teknikkene ikke som førstelinjediagnostiske tester. Det er sant at kommersielle PCR-tester er mye brukt til å diagnostisere M. pneumoniae-infeksjoner, men de kan fortsatt ikke erstatte serologi. Også den hyppige forekomsten av både falske negative og falske positive resultater har begrenset bruken av PCR9. Rutinemessig er serologi fortsatt den mest praktiserte i laboratorier for diagnose av M. pneumoniae-infeksjon. Flere serologitilnærminger har blitt rapportert i flere tiår, for eksempel kalde hemagglutininer, komplementfikseringstest11, indirekte hemagglutinasjonstest 12, immunfluorescens 13 og teknologien til ELISA, som først ble brukt på mykoplasma-serologi tidlig på 1980-tallet14,15,16. Et av de store problemene som oppstår ved utførelse av ELISA-serodiagnose av M. pneumoniae-infeksjon er kryssreaksjoner, noe som reduserer teknikkens spesifisitet betydelig. Ikke-spesifikk adsorpsjon av human sera med M. pneumoniae-antigener ble tidligere rapportert; Faktisk kan mange av antistoffene oppdaget av ELISA i human sera ikke alltid være bundet til mykoplasmatale antigener 17, på grunn av likheten til M. pneumoniae med noen bakterier18,19 og noen dyre- og menneskevev20.
På grunn av de høye bakgrunnsavlesningene som ble observert i den konvensjonelle ELISA-testen som ble praktisert i laboratoriet, var tolkningen av resultatene ofte komplisert, og dermed var levering av en riktig M. pneumoniae-diagnose en tøff oppgave. Mens vi møtte dette problemet, valgte vi å forbedre M. pneumoniae ELISA ved å fjerne ikke-spesifikke reaksjoner av M. pneumoniae-antigener med antistoffer som skal testes . For dette formålet jobbet vi med selektiv uttømming av de ikke-spesifikke M. pneumoniae-antigenene ved hjelp av adsorpsjonsteknikken. Faktisk er hovedmålet med antigenfangst ELISA å spesifikt oppdage M. pneumoniae immunoglobulin (Ig) G i humane serumprøver. Konseptet med denne ELISA består hovedsakelig av selektiv fangst av M. pneumoniae-spesifikke antigener, før tilsetning av humane serumprøver. Denne selektiviteten er forsikret ved å inkubere M. pneumoniae råantigen med et M. pneumoniae polyklonalt antiserum, produsert hos kaniner i laboratoriet og gjøre det artsspesifikt ved adsorpsjon mot et panel av heterologe bakterier, som tilhører eller ikke tilhører Mollicutes-klassen, deler antigener med M. pneumoniae arter og/eller kjent for å kolonisere luftveiene. Adsorpsjonsprosedyren ble gjentatt tre ganger, og effektiviteten for å eliminere kryssreaktivitet ble testet ved immunoblotting. Den utviklede ELISA-analysen er en kombinasjon av sandwich og indirekte ELISA. Kort fortalt blir brønnene på ELISA-platen først belagt med et polyklonalt antiserum spesifikt for M. pneumoniae. Deretter tilsettes M. pneumoniae-antigen og fanges mellom antiserumet og antistoffene som er tilstede i serumprøven som skal testes. Det dannede immunologiske komplekset påvises av et sekundært enzymkonjugert antistoff (peroksidasekonjugert IgG). Reaksjonene visualiseres ved tilsetning av kromogent substrat, og absorbansen måles spektrofotometrisk. Denne interne ELISA er skjematisk presentert i figur 1. Den hjemmelagde ELISA viste seg å være effektiv i å spesifikt oppdage M. pneumoniae-infeksjon og er for tiden en av de mest praktiserte testene i rutinemessig diagnostisk aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen presenterer en generell beskrivelse av en intern ELISA hovedsakelig utviklet for å sikre spesifikk screening av M. pneumoniae Infeksjon. Detaljer om selve ELISA-analyseprotokollen, samt noen før- og etterbehandlingstrinn, er gitt. Spesifisiteten til denne analysen sikres ved adsorpsjonsteknikken. Denne prosedyren ble tidligere beskrevet i ELISA-tester utviklet for diagnostisering av human og aviær Mycoplasmas17,24. Det ble og…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble finansiert av det tunisiske helsedepartementet og det tunisiske departementet for høyere utdanning og vitenskapelig forskning.
Materials
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
References
- Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
- Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
- Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
- Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
- Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
- Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
- Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
- Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
- Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
- Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
- Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, 79-82 (1993).
- Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
- Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
- Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
- Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
- Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
- Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
- Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
- Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
- Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
- Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
- Fawcett, P. T., O’Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
- Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
- Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, 243-249 (1993).
- Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
- Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
- Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
- Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
- Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
- Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
- Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
- Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
