Visualisierung der Mitophagie mit Fluoreszenzfarbstoffen für Mitochondrien und Lysosomen
Summary
Mitophagie ist der primäre Mechanismus der mitochondrialen Qualitätskontrolle. Die Bewertung der Mitophagie in vivo wird jedoch durch das Fehlen zuverlässiger quantitativer Assays behindert. Hier wird ein Protokoll zur Beobachtung der Mitophagie in lebenden Zellen unter Verwendung eines zellpermierten grün-fluoreszierenden Mitochondrienfarbstoffs und eines rot fluoreszierenden Lysosomenfarbstoffs vorgestellt.
Abstract
Mitochondrien, die Kraftwerke der Zelle, spielen eine wichtige Rolle bei der Bioenergetik, der Erzeugung freier Radikale, der Kalziumhomöostase und der Apoptose. Mitophagie ist der primäre Mechanismus der mitochondrialen Qualitätskontrolle und wird im Allgemeinen durch mikroskopische Beobachtung untersucht, jedoch sind In-vivo-Mitophagie-Assays schwierig durchzuführen. Die Bewertung der Mitophagie durch Bildgebung lebender Organellen ist eine alternative und notwendige Methode für die mitochondriale Forschung. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Verwendung des zellpermierten grün-fluoreszierenden Mitochondrienfarbstoffs MitoTracker Green und des rot fluoreszierenden Lysosomenfarbstoffs LysoTracker Red in lebenden Zellen, einschließlich der Beladung der Farbstoffe, der Visualisierung der Mitochondrien und des Lysosoms sowie der erwarteten Ergebnisse. Detaillierte Schritte zur Bewertung der Mitophagie in lebenden Zellen sowie technische Hinweise zu den Einstellungen der Mikroskopsoftware werden ebenfalls bereitgestellt. Diese Methode kann Forschern helfen, Mitophagie mit lebender Zellfluoreszenzmikroskopie zu beobachten. Darüber hinaus kann es verwendet werden, um Mitochondrien und Lysosomen zu quantifizieren und die mitochondriale Morphologie zu beurteilen.
Introduction
Mitochondrien sind die Kraftwerke fast aller eukaryotischen Zellen 1,2. Neben der ATP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle in anderen Prozessen wie Bioenergetik, Kalziumhomöostase, Erzeugung freier Radikale, Apoptose und zellulärer Homöostase 3,4,5. Da Mitochondrien reaktive Sauerstoffspezies (ROS) aus mehreren Komplexen in der Elektronentransportkette erzeugen, werden sie ständig durch potenziellen oxidativen Stress stimuliert, der schließlich zu strukturellen Schäden und Funktionsstörungen führen kann, wenn das antioxidative Abwehrsystem kollabiert 6,7. Es wurde festgestellt, dass mitochondriale Dysfunktion zu vielen Krankheiten beiträgt, einschließlich Stoffwechselstörungen, Neurodegeneration und Herz-Kreislauf-Erkrankungen8. Daher ist es wichtig, gesunde mitochondriale Populationen und ihre ordnungsgemäße Funktion zu erhalten. Mitochondrien sind hochplastische und dynamische Organellen; Ihre Morphologie und Funktion werden durch mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen kontrolliert, einschließlich posttranslationaler Modifikationen (PTM) von mitochondrialen Proteinen, mitochondrialer Biogenese, Fusion, Spaltung und Mitophagie 9,10. Die mitochondriale Spaltung, die durch das Dynamin-verwandte Protein 1 (DRP1), eine GTPase der Dynamin-Superfamilie von Proteinen, vermittelt wird, führt zu kleinen und runden Mitochondrien und isoliert die dysfunktionalen Mitochondrien, die durch Mitophagie11,12 gereinigt und abgebaut werden können.
Mitophagie ist ein zellulärer Prozess, der Mitochondrien selektiv durch Autophagie abbaut, die normalerweise in beschädigten Mitochondrien nach Verletzungen, Alterung oder Stress auftritt. Anschließend werden diese Mitochondrien an Lysosomen zum Abbauabgegeben 10. Daher ist die Mitophagie ein kataboler Prozess, der dazu beiträgt, die Quantität und Qualität der Mitochondrien in einem gesunden Zustand in einer Vielzahl von Zelltypen zu erhalten. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Wiederherstellung der zellulären Homöostase unter normalen physiologischen und Stressbedingungen13,14. Zellen zeichnen sich durch einen komplexen Mitophagiemechanismus aus, der durch verschiedene Signale von zellulärem Stress und Entwicklungsveränderungen induziert wird. Mitophagie-Regulationswege werden als Ubiquitin-abhängig oder Rezeptor-abhängig klassifiziert15,16; Die Ubiquitin-abhängige Autophagie wird durch die Kinase PINK1 und die Rekrutierung der Ubiquitin-Ligase Parkin E3 an die Mitochondrienvermittelt 17,18, während die rezeptorabhängige Autophagie die Bindung von Autophagierezeptoren an die Mikrotubuli-assoziierte Protein-Leichtkette LC3 beinhaltet, die Mitophagie als Reaktion auf mitochondriale Schäden vermittelt 19.
Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist die am häufigsten verwendete Methode und immer noch eine der besten Methoden zur Beobachtung und zum Nachweis der Mitophagie20. Die morphologischen Merkmale der Mitophagie sind Autophagosomen oder Autolysosomen, die durch die Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen gebildet werden, was aus elektronenmikroskopischen Bildern beobachtet werden kann21. Die Schwäche der Elektronenmikroskopie (EM) ist jedoch die Unfähigkeit, die dynamischen Prozesse der Mitophagie, wie mitochondriale Depolarisation, mitochondriale Spaltung und Fusion von Autophagosomen und Lysosomen, in der lebenden Zellezu überwachen 20. Daher ist die Bewertung der Mitophagie durch Bildgebung lebender Organellen eine attraktive alternative Methode für die mitochondriale Forschung. Die hier beschriebene Lebendzellbildgebungstechnik verwendet zwei Fluoreszenzfarbstoffe, um Mitochondrien und Lysosomen zu färben. Wenn Mitophagie auftritt, werden beschädigte oder überflüssige Mitochondrien, die von Autophagosomen verschlungen werden, durch den mitochondrialen Farbstoff grün gefärbt, während der rote Farbstoff die Lysosomen färbt. Die Verschmelzung dieser Autophagosomen und Lysosomen, die als Autolysosomen bezeichnet werden, bewirkt, dass sich die grüne und rote Fluoreszenz überlappen und sich als gelbe Punkte manifestieren, was auf das Auftreten von Mitophagiehinweist 22. Der zellpermierte Mitochondrienfarbstoff (MitoTracker Green) enthält einen leicht thiolreaktiven Chlormethylanteil, um Mitochondrien23 zu markieren. Um Mitochondrien zu markieren, werden Zellen einfach mit dem Farbstoff inkubiert, der passiv über die Plasmamembran diffundiert und sich in aktiven Mitochondrien ansammelt. Dieser Mitochondrienfarbstoff kann lebende Zellen leicht färben und ist weniger wirksam bei der Färbung von aldehydfixierten oder toten Zellen. Der Lysosomenfarbstoff (LysoTracker Red) ist eine fluoreszierende acidotrope Sonde, die zur Markierung und Verfolgung saurer Organellen in lebenden Zellen verwendet wird. Dieser Farbstoff weist eine hohe Selektivität für saure Organellen auf und kann lebende Zellen bei nanomolaren Konzentrationen effektiv markieren24.
Die Verfahren zur Verwendung dieser Fluoreszenzfarbstoffe in lebenden Zellen, einschließlich der Beladung der Farbstoffe und der Visualisierung von Mitochondrien und Lysosomen, werden hier vorgestellt. Diese Methode kann Forschern helfen, Mitophagie mit lebender Zellfluoreszenzmikroskopie zu beobachten. Es kann auch verwendet werden, um Mitochondrien und Lysosomen zu quantifizieren und die mitochondriale Morphologie zu beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll bietet eine Methode zur Bewertung und Überwachung des dynamischen Prozesses der Mitophagie in lebenden Zellen, an dem Autophagosomen, Lysosomen und mitochondriale Spaltung beteiligt sind, durch Co-Färbung mit zellpermeierten Mitochondrien und Lysosomenfarbstoffen. Die Methode kann auch verwendet werden, um Mitochondrien zu identifizieren und die mitochondriale Morphologie zu beurteilen. Beide in dieser Studie verwendeten Farbstoffe sollten vor Licht geschützt werden, mehrere Gefrier-Tau…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch das National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), die National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) und das Program for Professor of Special Appointment an Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008) finanziert.
Materials
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
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