Mitokondri ve Lizozom için Floresan Boyalarla Mitopajinin Görselleştirilmesi
Summary
Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolünün birincil mekanizmasıdır. Bununla birlikte, in vivo mitofajinin değerlendirilmesi, güvenilir kantitatif tahlillerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, hücre pervasıtalı yeşil-floresan mitokondri boyası ve kırmızı-floresan lizozom boyası kullanılarak canlı hücrelerde mitofajinin gözlemlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Hücrenin güç merkezleri olan mitokondri, biyoenerjetik çalışmalarda, serbest radikal oluşumunda, kalsiyum homeostazında ve apoptozda önemli roller oynamaktadır. Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolün birincil mekanizmasıdır ve genellikle mikroskobik gözlem kullanılarak incelenir, ancak in vivo mitofi tahlillerinin yapılması zordur. Mitofajiyi canlı organelleri görüntüleyerek değerlendirmek, mitokondriyal araştırmalar için alternatif ve gerekli bir yöntemdir. Bu protokol, boyaların yüklenmesi, mitokondri ve lizozomun görselleştirilmesi ve beklenen sonuçlar dahil olmak üzere, hücre perkastı yeşil floresan mitokondri boyası MitoTracker Green ve kırmızı floresan lizozom boyası LysoTracker Red’in canlı hücrelerde kullanılmasına ilişkin prosedürleri açıklar. Canlı hücrelerde mitofajinin değerlendirilmesi için ayrıntılı adımlar ve mikroskop yazılım ayarları hakkında teknik notlar da sağlanmaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların canlı hücreli floresan mikroskopi kullanarak mitofajiyi gözlemlemelerine yardımcı olabilir. Ek olarak, mitokondri ve lizozomları ölçmek ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Mitokondri, neredeyse tüm ökaryotik hücrelerin güç merkezleridir 1,2. Oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimine ek olarak, mitokondri biyoenerjetik kalsiyum homeostazı, serbest radikal üretimi, apoptoz ve hücresel homeostaz 3,4,5 gibi diğer süreçlerde hayati bir rol oynamaktadır. Mitokondri, elektron taşıma zincirindeki çoklu komplekslerden reaktif oksijen türleri (ROS) ürettiğinden, antioksidan savunma sistemi çöktüğünde yapısal hasara ve işlev bozukluğuna yol açabilecek potansiyel oksidatif stres tarafından sürekli olarak uyarılırlar 6,7. Mitokondriyal disfonksiyonun metabolik bozukluklar, nörodejenerasyon ve kardiyovasküler hastalık8 dahil olmak üzere birçok hastalığa katkıda bulunduğu bulunmuştur. Bu nedenle, sağlıklı mitokondriyal popülasyonları ve bunların uygun işlevlerini korumak çok önemlidir. Mitokondri oldukça plastik ve dinamik organellerdir; morfolojileri ve fonksiyonları, mitokondriyal proteinlerin post-translasyonel modifikasyonları (PTM), mitokondriyal biyogenez, füzyon, fisyon ve mitofaji 9,10 dahil olmak üzere mitokondriyal kalite kontrol mekanizmaları tarafından kontrol edilir. Proteinlerin dinamin süper ailesinin bir GTPazı olan dinamin ile ilişkili protein 1’in (DRP1) aracılık ettiği mitokondriyal fisyon, küçük ve yuvarlak mitokondri ile sonuçlanır ve mitofaji11,12 tarafından temizlenebilen ve parçalanabilen işlevsiz mitokondrileri izole eder.
Mitofaji, mitokondrileri otofaji ile seçici olarak bozan, genellikle yaralanma, yaşlanma veya stresten sonra hasarlı mitokondrilerde ortaya çıkan hücresel bir süreçtir. Daha sonra, bu mitokondriler bozulma10 için lizozomlara verilir. Bu nedenle, mitofaji, mitokondrinin miktarını ve kalitesini çok çeşitli hücre tiplerinde sağlıklı bir durumda tutmaya yardımcı olan katabolik bir süreçtir. Normal fizyolojik ve stres koşulları altında hücresel homeostazın restorasyonunda çok önemli bir rol oynar13,14. Hücreler, farklı hücresel stres sinyalleri ve gelişimsel değişiklikler tarafından indüklenen karmaşık bir mitofaji mekanizması ile karakterizedir. Mitopaji düzenleyici yolakları ubikitine bağımlı veya reseptöre bağımlı15,16 olarak sınıflandırılır; ubikitin bağımlı otofajiye kinaz PINK1 ve ubikitin ligaz Parkin E3’ün mitokondri17,18’e alınması aracılık ederken, reseptöre bağımlı otofaji, otofaji reseptörlerinin mitokondriyal hasara yanıt olarak mitofajiye aracılık eden mikrotübül ile ilişkili protein hafif zincir LC3’e bağlanmasını içerir19.
İletim elektron mikroskobu (TEM), mitofaji20’yi gözlemlemek ve tespit etmek için en yaygın kullanılan yöntemdir ve hala en iyi yöntemlerden biridir. Mitofajinin morfolojik özellikleri, otofagozomların lizozomlarla füzyonu ile oluşan otofagozomlar veya otolizozomlardır ve elektron mikroskobu görüntülerinden gözlemlenebilir21. Bununla birlikte, elektron mikroskobunun (EM) zayıflığı, mitokondriyal depolarizasyon, mitokondriyal fisyon ve otofagozomların ve lizozomların füzyonu gibi mitofajinin dinamik süreçlerini canlı hücre20’de izleyememektir. Bu nedenle, canlı organelleri görüntüleme yoluyla mitofajiyi değerlendirmek, mitokondriyal araştırmalar için cazip bir alternatif yöntemdir. Burada açıklanan canlı hücre görüntüleme tekniği, mitokondri ve lizozomları boyamak için iki floresan boya kullanır. Mitofaji meydana geldiğinde, otofagozomlar tarafından yutulan hasarlı veya gereksiz mitokondri, mitokondriyal boya tarafından yeşile boyanırken, kırmızı boya lizozomları boyar. Otolizozomlar olarak adlandırılan bu otofagozomların ve lizozomların füzyonu, yeşil ve kırmızı floresanın üst üste binmesine ve sarı noktalar olarak tezahür etmesine neden olur, böylece mitofaji22’nin oluşumunu gösterir. Hücre perkastı mitokondri boyası (MitoTracker Green), mitokondri23’ü etiketlemek için hafif bir tiol-reaktif klorometil moiety içerir. Mitokondrileri etiketlemek için, hücreler plazma zarı boyunca pasif olarak yayılan ve aktif mitokondride biriken boya ile basitçe inkübe edilir. Bu mitokondri boyası canlı hücreleri kolayca lekeleyebilir ve aldehit ile sabitlenmiş veya ölü hücrelerin boyanmasında daha az etkilidir. Lizozom boyası (LysoTracker Red), canlı hücrelerdeki asidik organelleri etiketlemek ve izlemek için kullanılan floresan asidotropik bir probdur. Bu boya, asidik organeller için yüksek bir seçicilik sergiler ve canlı hücreleri nanomolar konsantrasyonlarda etkili bir şekilde etiketleyebilir24.
Bu floresan boyaların, boyaların yüklenmesi ve mitokondri ve lizozomların görselleştirilmesi de dahil olmak üzere canlı hücrelerde kullanılması için prosedürler burada sunulmuştur. Bu yöntem, araştırmacıların canlı hücreli floresan mikroskopi kullanarak mitofajiyi gözlemlemelerine yardımcı olabilir. Mitokondri ve lizozomları ölçmek ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, canlı hücrelerde otofagozomlar, lizozomlar ve mitokondriyal fisyonu içeren dinamik mitofaji sürecini, hücre perkastlı mitokondri ve lizozom boyaları ile birlikte boyama yoluyla değerlendirmek ve izlemek için bir yöntem sağlar. Yöntem ayrıca mitokondrileri tanımlamak ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu çalışmada kullanılan her iki boya da ışıktan korunmalı, çoklu donma-çözülme döngülerinden kaçınılmalı ve boyalar mümkün ol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81970333,31901044) ve Şangay Yüksek Öğrenim Kurumlarında Özel Atama Profesörü Programı (GZ2020008) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
- Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
- Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
- Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
- Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
- Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
- Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
- Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
- Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
- Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
- Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
- Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
- Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
- Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
- Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).
