HPLC Juntamente com Impressão Digital Química para Reconhecimento de Multi-Padrões para Identificar a Autenticidade de Clematidis Armandii Caulis
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), juntamente com o reconhecimento químico de multi-padrão de impressão digital, que fornece uma nova estratégia para identificar efetivamente as variedades genuínas de Clematidis Armandii Caulis e seus adulterantes.
Abstract
Um método para identificar materiais medicinais chineses e seus adulterantes relacionados foi construído tomando Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, uma medicina tradicional chinesa universalmente usada) como exemplo. Dez lotes de variedades genuínas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes relacionados foram analisados e comparados com base nas impressões digitais de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) combinadas com quimiometria, incluindo análise de cluster (CA), análise de componentes principais (PCA) e análise ortogonal parcial de discriminação de mínimos quadrados (OPLS-DA). Além disso, o teor de β-sitosterol foi determinado. A impressão digital química de controle de Chuanmutong foi estabelecida, e 12 picos comuns foram identificados. A semelhança entre a impressão digital de 10 lotes de variedades Chuanmutong genuínas e a impressão digital de controle foi de 0,910-0,989, enquanto a similaridade de cinco lotes de adulterantes foi de apenas 0,133-0,720. Com base nos picos comuns no cromatograma, 15 lotes de amostras foram classificados em três níveis de conteúdo por PCA, e foram agregados em quatro categorias por CA, alcançando uma clara distinção entre Chuanmutong autêntico e adulterantes de Chuanmutong. Além disso, sete componentes diferenciais que podem efetivamente identificar Chuanmutong autênticos e adulterantes de Chuanmutong foram encontrados através do OPLS-DA. O teor de β-sitosterol de 10 lotes de variedades genuínas de Chuanmutong foi de 97,53-161,56 μg/g, enquanto o teor de β-sitosterol dos cinco lotes de adulterantes variou muito, entre os quais o teor de β-sitosterol de Clematis peterae Hand.-Mazz. e Clematis gouriana Roxb. Fintii Rehd. et Wils. foi significativamente menor do que a das variedades autênticas de Chuanmutong. O conteúdo do componente do índice HPLC e o método de reconhecimento multipadrão de impressão digital química estabelecido neste estudo fornecem uma nova estratégia para identificar efetivamente materiais medicinais chineses autênticos e adulterantes relacionados.
Introduction
Chuanmutong, Caulis seco de Clematis armandii Franch. ou Clematis montana Buch.-Ham., é uma medicina tradicional chinesa comumente utilizada em clínicas 1,2,3. É utilizado para o tratamento de problemas urinários, edema, feridas na língua e na boca, diminuição da secreção de leite, rigidez articular e dores musculares causadas pelo calor úmido4. Chuanmutong sempre foi obtido a partir de variedades silvestres, distribuídas principalmente no sudoeste da China, especialmente em Sichuan, onde a melhor qualidade pode ser encontrada 5,6. É difícil distinguir entre variedades autênticas e seus adulterantes intimamente relacionados devido às suas características semelhantes 7,8,9,10. O padrão de qualidade de Chuanmutong na edição de 2020 da Farmacopeia Chinesa estipula apenas as propriedades, a identificação microscópica e a identificação de camada fina sem determinação de conteúdo, que não podem efetivamente identificar os adulterantes e, portanto, têm riscos potenciais. Além disso, há poucos relatos comparando e identificando Chuanmutong e plantas relacionadas. Consequentemente, um método de controle de qualidade para garantir a autenticidade de Chuanmutong é digno de um estudo mais aprofundado.
Os constituintes químicos do Chuanmutong são compostos principalmente de triterpenóides pentacíclicos do tipo oleanona e seus glicosídeos, flavonoides e ácidos orgânicos11,12,13,14. Dentre eles, o ácido oleanólico, o β-sitosterol, o estigmasterol e o ergosterol têm efeitos diuréticos de diferentes intensidades, o que pode ser potencial substância farmacodinâmica para promover a diurese e aliviar a estrangulia15,16. As impressões digitais químicas são obtidas separando e detectando muitos componentes químicos contidos em amostras por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia gasosa (GC), etc. A adoção de métodos de análise estatística adequados para analisar as características de Chuanmutong pode determinar o controle geral de qualidade e a identificação científica da medicina tradicional chinesa17,18,19.
Neste estudo, foram coletados 10 lotes de variedades autênticas de Chuanmutong e cinco lotes de adulterantes. Sua qualidade foi comparada e analisada pelo método de impressão digital por HPLC combinado com reconhecimento de múltiplos padrões, incluindo análise de cluster (AC), análise de componentes principais (PCA), análise ortogonal parcial de discriminação de mínimos quadrados (OPLS-CA) e determinação de conteúdo do componente farmacodinâmico. Este protocolo estabelece um método para identificar variedades autênticas com alta especificidade, uma nova estratégia para a identificação científica de variedades autênticas e adulterantes de materiais medicinais chineses.
Protocol
Representative Results
Discussion
A coleta de amostras para pesquisa é o primeiro passo fundamental para a construção do reconhecimento de vários padrões na identificação da autenticidade dos materiais medicinais chineses. Através de pesquisas de mercado, descobrimos que Sichuan Ya’an, Liangshan e Leshan são as principais áreas de produção de recursos selvagens de Chuanmutong. As variedades relacionadas do mesmo gênero também têm a mesma distribuição geográfica 6,20; CC, DC, DE,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Administração de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan (n.º 2020JC0088, n.º 2021MS203).
Materials
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | – | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | – | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | – | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | – | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | – | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
- Chen, C. R. . Chinese Medicine Specimen Picture Book. , 116 (1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
- Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. . Pharmacopoeia of The People’s Republic of China: (Edition 2020). , 38 (2020).
- Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
- Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
- Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
- Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
- Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
- Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
- Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
- Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
- Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
- Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
- Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
- Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
- Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
- Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
- Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
- Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
- Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
- Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
- Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
- Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
- Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
- Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).
