Summary

HPLC junto con huellas dactilares químicas para el reconocimiento de múltiples patrones para identificar la autenticidad de Clematidis armandii caulis

Published: November 11, 2022
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para establecer la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), junto con el reconocimiento químico de huellas dactilares multipatrón, que proporciona una nueva estrategia para identificar eficazmente las variedades genuinas de Clematidis Armandii Caulis y sus adulterantes.

Abstract

Un método para identificar los materiales medicinales chinos y sus adulterantes relacionados se construyó tomando como ejemplo Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, una medicina tradicional china universalmente utilizada). Se analizaron y compararon diez lotes de variedades genuinas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes relacionados con la base de las huellas dactilares de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) combinadas con quimiometría, incluido el análisis de conglomerados (CA), el análisis de componentes principales (PCA) y el análisis ortogonal de discriminación parcial de mínimos cuadrados (OPLS-DA). Además, se determinó el contenido de β-sitosterol. Se estableció la huella dactilar química de control de Chuanmutong y se identificaron 12 picos comunes. La similitud entre la huella digital de 10 lotes de variedades genuinas de Chuanmutong y la huella digital de control fue de 0.910-0.989, mientras que la similitud de cinco lotes de adulterantes fue de solo 0.133-0.720. Sobre la base de los picos comunes en el cromatograma, 15 lotes de muestras se clasificaron en tres niveles de contenido por PCA, y se agregaron en cuatro categorías por CA, logrando una clara distinción entre Chuanmutong auténtico y adulterantes de Chuanmutong. Además, se encontraron siete componentes diferenciales que pueden identificar efectivamente Chuanmutong auténtico y adulterantes de Chuanmutong a través de OPLS-DA. El contenido de β-sitosterol de 10 lotes de variedades genuinas de Chuanmutong fue de 97.53-161.56 μg / g, mientras que el contenido de β-sitosterol de los cinco lotes de adulterantes varió mucho, entre los cuales el contenido de β-sitosterol de Clematis peterae Hand.-Mazz. y Clematis gouriana Roxb. var. finetii Rehd. et Wils. fue significativamente menor que la de las variedades auténticas de Chuanmutong. El contenido del componente del índice HPLC y el método de reconocimiento de huellas dactilares químicas de múltiples patrones establecido en este estudio proporcionan una nueva estrategia para identificar eficazmente los materiales medicinales chinos auténticos y los adulterantes relacionados.

Introduction

Chuanmutong, Caulis seco de Clematis armandii Franch. o Clematis montana Buch.-Ham., es una medicina tradicional china comúnmente utilizada en clínicas 1,2,3. Se utiliza para tratar problemas urinarios, edema, llagas en la lengua y la boca, disminución de la secreción de leche, rigidez articular y dolor muscular causado por el calor húmedo4. Chuanmutong siempre se ha obtenido a partir de variedades silvestres, distribuidas principalmente en el suroeste de China, especialmente en Sichuan, donde la mejor calidad se puede encontrar 5,6. Es difícil distinguir entre variedades auténticas y sus adulterantes estrechamente relacionados debido a sus características similares 7,8,9,10. El estándar de calidad de Chuanmutong en la edición 2020 de la Farmacopea China solo estipula las propiedades, la identificación microscópica y la identificación en capa delgada sin determinación de contenido, que no pueden identificar eficazmente los adulterantes y, por lo tanto, tienen riesgos potenciales. Además, hay pocos informes que comparen e identifican Chuanmutong y plantas relacionadas. En consecuencia, un método de control de calidad para garantizar la autenticidad de Chuanmutong es digno de estudio adicional.

Los componentes químicos de Chuanmutong están compuestos principalmente de triterpenoides pentacíclicos de tipo oleanano y sus glucósidos, flavonoides y ácidos orgánicos11,12,13,14. Entre ellos, el ácido oleanólico, el β-sitosterol, el estigmasterol y el ergosterol tienen efectos diuréticos de diferentes intensidades, que pueden ser sustancias farmacodinámicas potenciales para promover la diuresis y aliviar la estranguria15,16. Las huellas químicas se obtienen separando y detectando muchos componentes químicos contenidos en las muestras mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de gases (GC), etc. La adopción de métodos de análisis estadístico apropiados para analizar las características de Chuanmutong puede determinar el control de calidad general y la identificación científica de la medicina tradicional china17,18,19.

En este estudio, se recolectaron 10 lotes de variedades auténticas de Chuanmutong y cinco lotes de adulterantes. Su calidad se comparó y analizó mediante el método de huellas dactilares HPLC combinado con el reconocimiento de patrones múltiples, incluido el análisis de conglomerados (AC), el análisis de componentes principales (PCA), el análisis ortogonal de discriminación parcial de mínimos cuadrados (OPLS-CA) y la determinación del contenido del componente farmacodinámico. Este protocolo establece un método para identificar variedades auténticas con alta especificidad, una nueva estrategia para la identificación científica de variedades auténticas y adulterantes de materiales medicinales chinos.

Protocol

1. Métodos de detección química de huellas dactilares Condiciones cromatográficasPreparar la fase móvil acetonitrilo (A)/agua (B). Establezca un programa de degradado de la siguiente manera en el software HPLC: 0-20 min, 3%A-10%A; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A. Mantener el caudal de la fase móvil a 1,0 mL/min. Realizar la separación cromatográfica en una columna C18 (250 mm x 4,6 mm…

Representative Results

Huella cromatográfica de Chuanmutong y análisis de similitud (SA)Los valores de RSD del tiempo de retención relativo de precisión, repetibilidad y estabilidad fueron inferiores a 0,46%, 1,65% y 0,53%, respectivamente; los valores de RSD del área pico relativa fueron inferiores a 4,23%, 3,56% y 3,96%, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 1A, B, hubo 12 picos comunes distintos (desde el pico 1 hasta el pico 12) en las huellas dactilares de …

Discussion

La recolección de muestras para la investigación es el primer paso clave para construir el reconocimiento de múltiples patrones en la identificación de la autenticidad de los materiales medicinales chinos. A través de la investigación de mercado, descubrimos que Sichuan Ya’an, Liangshan y Leshan son las principales áreas de producción de recursos silvestres de Chuanmutong. Las variedades relacionadas del mismo género también tienen la misma distribución geográfica 6,20<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Administración de Medicina Tradicional China de Sichuan (no. 2020JC0088, no. 2021MS203).

Materials

Acetic acid Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017381038
Acetonitrile Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD5243V
β-Sitosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
 C18 column Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China Welch Ultimate LP
Chuanmutong Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  19020103 CMT-1
Chuanmutong Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-2
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-3
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-4
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210701 CMT-5
Chuanmutong Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210401 CMT-6
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-7
Chuanmutong Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China  201201 CMT-8
Chuanmutong Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  201001 CMT-9
Chuanmutong Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 210501 CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China  CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China  DC
Clematis peterae Hand.-Mazz. Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China  DE
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot. Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  SMT
Electronic balance Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai,  China  FA1204
Ergosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China 20210201
Ethanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2021112602
Ethyl acetate Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017042043
Formic acid Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2016062901
High performance liquid chromatography Agilent, USA. 1260
IBM SPSS Statistics version 26.0 International Business Machines Corporation, USA
Methanol Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD6409V
Methanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 202010302
n-butyl alcohol Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020071047
Petroleum ether Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020090125
Phosphoric acid Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 20200110
SESCF-TCM version 2012 National Pharmacopoeia Commission, China http://114.247.108.158:8888/login
Stigmasterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
Trichloromethane Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China 20200214
Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 Umetrics, Sweden https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
Ultrapure water machine Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China UPH-II-10T
Ultrasonic cleaner Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China KH3200E

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Wang, F., Qian, Z., Liao, G., Zeng, J., Huang, D., Liu, Q., Xie, X. HPLC Coupled with Chemical Fingerprinting for Multi-Pattern Recognition for Identifying the Authenticity of Clematidis Armandii Caulis. J. Vis. Exp. (189), e64690, doi:10.3791/64690 (2022).

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