Summary

בדיקת מלכיט ירוק לגילוי מעכבי חלבון הלם חום 90

Published: January 20, 2023
doi:

Summary

פרוטוקול הבדיקה הירוק של מלכיט הוא שיטה פשוטה וחסכונית לגילוי מדכאי חלבון הלם חום 90 (Hsp90), כמו גם תרכובות מעכבות אחרות נגד אנזימים תלויי ATP.

Abstract

חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא מטרה אנטי-סרטנית מבטיחה בגלל השפעתו הנלווית על חלבונים אונקוגניים מרובים. הפעילות של Hsp90 תלויה ביכולתו לבצע הידרוליזה של אדנוזין טריפוספט (ATP) לאדנוזין דיפוספט (ADP) ולפוספט חופשי. פעילות ATPase של Hsp90 קשורה לפונקציית הליווי שלו; ATP נקשר לתחום N-terminal של Hsp90, ושיבוש הקשירה שלו נמצא כאסטרטגיה המוצלחת ביותר בדיכוי פונקציית Hsp90. ניתן למדוד את פעילות ה-ATPase על ידי בדיקת מלכיט ירוק קולורימטרי, הקובעת את כמות הפוספט החופשי שנוצר על ידי הידרוליזה של ATP. כאן מתואר הליך לקביעת פעילות ATPase של שמרים Hsp90 באמצעות ערכת בדיקת פוספט ירוק מלכיט. יתר על כן, הוראות מפורטות לגילוי מעכבי Hsp90 על ידי נטילת geldanamycin כמעכב אותנטי מסופק. לבסוף, נדון היישום של פרוטוקול בדיקה זה באמצעות סינון בתפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות מעכבות כנגד שמרים Hsp90.

Introduction

חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא מלווה מולקולרי השומר על יציבות החלבונים האחראים להתפתחות והתקדמות סרטן. בנוסף, חלבונים האחראים על התפתחות עמידות לחומרים אנטינאופלסטיים הם גם לקוחות של Hsp901. Hsp90 מתבטא יתר על המידה בכל סוגי התאים הסרטניים (>90% מהחלבונים התאיים), בהשוואה לתאים רגילים שבהם הוא עשוי להוות פחות מ-2% מכלל החלבונים. יתר על כן, Hsp90 של תאים סרטניים שוכן בקומפלקס עם מלווים משותפים, בעוד שבתא רגיל הוא נמצא בעיקר במצב חופשי, לא מורכב 2,3. בשנים האחרונות, מספר מעכבי Hsp90 הוכחו כבעלי השפעות סנוליטיות במחקרי in vitro ו-in vivo, שם הם שיפרו באופן משמעותי את תוחלת החיים של עכברים 4,5,6. כל הממצאים הנ”ל מאששים את העובדה שמעכבי Hsp90 יכולים להיות יעילים במספר סוגי סרטן, עם פחות תופעות לוואי וסיכויים מופחתים לפתח עמידות. פונקציית הליווי של Hsp90 מושגת על ידי קשירת ATP בתחום N-terminal של Hsp90 והידרוליזה שלו ל-ADP ולפוספט חופשי7. מולקולות קטנות שנקשרות באופן תחרותי לכיס קשירת ה-ATP של Hsp90 נמצאו כמדכאות בהצלחה את השפעת הליווי של החלבון. נכון להיום, זו נותרה האסטרטגיה הטובה ביותר עבור עיכוב Hsp90, אשר נתמך על ידי העובדה כי מעכבים כאלה הגיעו לניסויים קליניים8. אחד מהם, Pimitespib, אושר ביפן לטיפול בגידול סטרומה במערכת העיכול (GIST) ביוני 20229. זהו מעכב Hsp90 הראשון שאושר מאז הוקמה יכולת הטיפול התרופתי של המלווה בשנת 199410.

בדיקת מלכיט ירוק היא הליך פשוט, רגיש, מהיר וזול לאיתור פוספט אנאורגני, המתאים לאוטומציה ולסינון תפוקה גבוהה (HTS) של תרכובות כנגד היעד הרצוי11. הבדיקה שימשה בהצלחה לסינון מעכבי Hsp90 בתצורות מעבדה קטנות, כמו גם ב- HTS 12,13,14,15,16,17. הבדיקה משתמשת בשיטה קולורימטרית הקובעת את הפוספט האי-אורגני החופשי שנוצר עקב פעילות ATPase של Hsp90. הבסיס לכימות הזה הוא היווצרות קומפלקס פוספוהומוליבדט בין פוספט חופשי למוליבדן, אשר לאחר מכן מגיב עם ירוק מלכיט ליצירת צבע ירוק (איור 1). היווצרות צבע מהירה זו נמדדת על ספקטרופוטומטר, או על קורא לוחות, בין 600-660 ננומטר18,19.

בפרוטוקול הנוכחי מתואר ההליך לביצוע בדיקה ירוקה מלכיט עם שמרים Hsp90 וזיהוי עוקב של מעכבים נגד המלווה. מולקולת המוצר הטבעית, geldanamycin (GA), שבה נקבעה לראשונה יכולת התרופה של Hsp90, נלקחה כמעכב אותנטי10. HTS הפך לחלק בלתי נפרד מתוכנית גילוי התרופות הנוכחית, בשל זמינותן של מספר רב של מולקולות לבדיקה. טכניקה זו קיבלה משמעות רבה יותר בשנתיים האחרונות בגלל הצורך הדחוף בייעוד מחדש של תרופות לטיפול בזיהום Covid-1920,21. לכן, מוצג מתווה מפורט ל-HTS של מולקולות כנגד חלבון שמרים Hsp90 על ידי אימוץ שיטת הבדיקה הירוקה מלכיט.

Protocol

1. בדיקת מלכיט ירוק בקנה מידה מעבדתי הכנת מאגר בדיקההכינו את מאגר הבדיקה, בהתאם להרכב ולהכנה המוצגים בטבלה 1. הכנת תקני פוספטיש להשתמש בתקן פוספט 1 mM, המסופק בערכת בדיקת פוספט ירוק מלכיט (מאוחסן ב- 4 °C). פיפטה 40 μL של 1 mM פוספט סטנדרטי ב 960 μL של מ?…

Representative Results

תוצאות הבדיקה מפורשות במונחים של ספיגה עקב ריכוז יוני פוספט חופשי. ספיגה על ידי פוספט חופשי עקב הידרוליזה ATP על ידי שמרים Hsp90 ב 620 ננומטר נחשב 100% פעילות ATPase, או אפס אחוז עיכוב חלבון. עיכוב החלבון מוביל להפסקת הידרוליזה של ATP (פחות פוספט חופשי). אשר באה לידי ביטוי במונחים של ירידה בספיגה ב 620 ננו…

Discussion

Hsp90 הוא יעד משמעותי לגילוי מולקולות תרופות אנטי-סרטניות חדשניות. מאז התבססה יכולת הטיפול התרופתי שלה בשנת 1994,10, 18 מולקולות הגיעו לניסויים קליניים. כיום, שבע מולקולות נמצאות בשלבים שונים של ניסויים קליניים, לבדן או בשילוב22. כל המולקולות הקטנות הללו הן מעכבי קשירת AT…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מלגות המחקר של קוריאה (KRF), עמית פוסט-דוקטורט של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), במימון משרד המדע והתקשוב (NRF-2019H1D3A1A01102952). המחברים מודים למענק KIST ולמענק משרד האוקיינוסים והדיג מספר 2MRB130 על מתן סיוע כספי לפרויקט זה.

Materials

1M Magnesium chloride solution in water Sigma-Aldrich 63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water Sigma-Aldrich 60142-100ml
96-well plate SPL Life Sciences Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation Beckman Coulter Not applicable
Compounds 3-96 Not applicable Not applicable Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder AK Scientific, Inc. V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit Sigma-Aldrich MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Synergy HT multi-plate reader Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 Sigma-Aldrich 93313-1L
Yeast Hsp90 Not applicable Not applicable School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829

References

  1. Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
  2. Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
  3. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  4. Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
  5. Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
  6. Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
  7. Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
  8. Park, H. -. K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
  9. Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
  10. Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
  11. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  12. Sheikha, G. A., Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
  13. Al-Sha’er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
  14. Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
  15. Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
  16. Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
  17. Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
  18. Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
  19. Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
  20. Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
  21. Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
  22. Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).
  23. Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
  24. Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
  25. Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
  26. Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
  27. Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
  28. Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
  29. Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
  30. Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
  31. Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
  32. Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
  33. Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).

Play Video

Cite This Article
Gupta, S. D., Song, D., Lee, S., Lee, J. W., Park, J., Prodromou, C., Pan, C. Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors. J. Vis. Exp. (191), e64693, doi:10.3791/64693 (2023).

View Video