Summary

Saggio verde malachite per la scoperta degli inibitori della proteina 90 da shock termico

Published: January 20, 2023
doi:

Summary

Il protocollo di analisi del verde malachite è un metodo semplice ed economico per scoprire i soppressori della proteina da shock termico 90 (Hsp90) e altri composti inibitori contro gli enzimi ATP-dipendenti.

Abstract

La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un promettente bersaglio antitumorale a causa del suo effetto chaperoning su più proteine oncogeniche. L’attività di Hsp90 dipende dalla sua capacità di idrolizzare l’adenosina trifosfato (ATP) in adenosina difosfato (ADP) e fosfato libero. L’attività ATPasi di Hsp90 è legata alla sua funzione chaperoning; L’ATP si lega al dominio N-terminale dell’Hsp90 e interrompere il suo legame si è rivelata la strategia di maggior successo nel sopprimere la funzione Hsp90. L’attività dell’ATPasi può essere misurata mediante un saggio colorimetrico di verde malachite, che determina la quantità di fosfato libero formato dall’idrolisi dell’ATP. Qui viene descritta una procedura per determinare l’attività dell’ATPasi del lievito Hsp90 utilizzando il kit di analisi del fosfato verde malachite. Inoltre, vengono fornite istruzioni dettagliate per la scoperta degli inibitori Hsp90 assumendo geldanamicina come inibitore autentico. Infine, viene discussa l’applicazione di questo protocollo di analisi attraverso lo screening ad alta produttività (HTS) di molecole inibitrici contro il lievito Hsp90.

Introduction

La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un chaperone molecolare che mantiene la stabilità delle proteine responsabili dello sviluppo e della progressione del cancro. Inoltre, le proteine responsabili dello sviluppo della resistenza agli agenti antineoplastici sono anche clienti di Hsp901. Hsp90 è sovraespresso ubiquitariamente in tutti i tipi di cellule tumorali (>90% delle proteine cellulari), rispetto alle cellule normali dove può costituire meno del 2% delle proteine totali. Inoltre, l’Hsp90 delle cellule tumorali risiede in un complesso con co-chaperoni, mentre in una cellula normale è presente prevalentemente in uno stato libero e non complessato 2,3. Negli ultimi anni, diversi inibitori di Hsp90 hanno dimostrato di possedere effetti senolitici in studi in vitro e in vivo, dove hanno migliorato significativamente la durata della vita dei topi 4,5,6. Tutti i risultati di cui sopra confermano il fatto che gli inibitori Hsp90 potrebbero essere efficaci in più tipi di cancro, con meno effetti avversi e minori possibilità di sviluppare resistenza. La funzione chaperoning di Hsp90 si ottiene legando l’ATP al dominio N-terminale di Hsp90 e idrolizzandolo in ADP e fosfato libero7. Piccole molecole che si legano in modo competitivo alla tasca di legame ATP di Hsp90 sono state trovate per sopprimere con successo l’effetto chaperoning della proteina. Ad oggi, questa rimane la migliore strategia per l’inibizione di Hsp90, che è supportata dal fatto che tali inibitori hanno raggiunto studi clinici8. Uno di questi, Pimitespib, è stato approvato in Giappone per il trattamento del tumore stromale gastrointestinale (GIST) nel giugno 20229. Questo è il primo inibitore Hsp90 approvato da quando la farmacogabilità dello chaperone è stata stabilita nel 199410.

Il test del verde malachite è una procedura semplice, sensibile, veloce ed economica per la rilevazione del fosfato inorganico, adatta per l’automazione e lo screening ad alta produttività (HTS) dei composti rispetto al target desiderato11. Il test è stato impiegato con successo per lo screening degli inibitori Hsp90 in piccole configurazioni su scala di laboratorio, nonché in un HTS 12,13,14,15,16,17. Il test utilizza un metodo colorimetrico che determina il fosfato inorganico libero formato a causa dell’attività ATPasi di Hsp90. La base di questa quantificazione è la formazione di un complesso fosfomolibdato tra fosfato libero e molibdeno, che successivamente reagisce con il verde malachite per generare un colore verde (Figura 1). Questa rapida formazione di colore viene misurata su uno spettrofotometro, o su un lettore di piastre, tra 600-660 nm18,19.

Nel presente protocollo, viene descritta la procedura per eseguire un test verde malachite con lievito Hsp90 e successiva identificazione degli inibitori contro lo chaperone. La molecola del prodotto naturale, la geldanamicina (GA), con la quale è stata stabilita per la prima volta la farmacogabilità di Hsp90, è stata assunta come un autentico inibitore10. L’HTS è diventato parte integrante dell’attuale programma di scoperta di farmaci, grazie alla disponibilità di un gran numero di molecole per i test. Questa tecnica ha acquisito maggiore importanza negli ultimi 2 anni a causa dell’urgente necessità di riutilizzare i farmaci per il trattamento dell’infezione da Covid-1920,21. Pertanto, viene presentato uno schema dettagliato per l’HTS delle molecole contro la proteina Hsp90 del lievito adottando il metodo del saggio verde malachite.

Protocol

1. Saggio verde malachite su scala di laboratorio Preparazione del tampone di analisiPreparare il tampone di analisi, secondo la composizione e la preparazione presentate nella Tabella 1. Preparazione di norme sui fosfatiUtilizzare 1 mM di fosfato standard, fornito nel kit di dosaggio del fosfato verde malachite (conservato a 4 °C). Pipettare 40 μL di 1 mM fosfato standard in 960 μL di acqua ultrapura per ottenere una soluzion…

Representative Results

I risultati del saggio sono interpretati in termini di assorbanza dovuta alla concentrazione di ioni fosfato libero. L’assorbanza da parte del fosfato libero dovuta all’idrolisi dell’ATP da parte del lievito Hsp90 a 620 nm è considerata come attività dell’ATPasi al 100%, o inibizione proteica a percentuale zero. L’inibizione delle proteine porta alla cessazione dell’idrolisi dell’ATP (meno fosfato libero). che si riflette in termini di diminuzione dell’assorbanza a 620 nm. Risultati …

Discussion

Hsp90 è un obiettivo significativo per la scoperta di nuove molecole di farmaci antitumorali. Da quando la sua farmacogabilità è stata stabilita nel 199410, 18 molecole hanno raggiunto studi clinici. Attualmente, sette molecole sono in varie fasi di studi clinici, da sole o in combinazione22. Tutte queste piccole molecole sono inibitori leganti l’ATP N-terminali. Gli altri mezzi per inibire il chaperone (inibitori C-terminali, inibitori del dominio medio) non hanno proce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto dal programma Korea Research Fellowship (KRF), borsista post-dottorato della National Research Foundation of Korea (NRF), finanziato dal ministero della scienza e delle TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Gli autori sono grati alla sovvenzione intramurale KIST e alla sovvenzione numero 2MRB130 del Ministero degli Oceani e della Pesca per aver fornito assistenza finanziaria a questo progetto.

Materials

1M Magnesium chloride solution in water Sigma-Aldrich 63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water Sigma-Aldrich 60142-100ml
96-well plate SPL Life Sciences Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation Beckman Coulter Not applicable
Compounds 3-96 Not applicable Not applicable Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder AK Scientific, Inc. V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit Sigma-Aldrich MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Synergy HT multi-plate reader Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 Sigma-Aldrich 93313-1L
Yeast Hsp90 Not applicable Not applicable School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829

References

  1. Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
  2. Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
  3. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  4. Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
  5. Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
  6. Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
  7. Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
  8. Park, H. -. K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
  9. Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
  10. Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
  11. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  12. Sheikha, G. A., Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
  13. Al-Sha’er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
  14. Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
  15. Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
  16. Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
  17. Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
  18. Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
  19. Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
  20. Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
  21. Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
  22. Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).
  23. Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
  24. Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
  25. Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
  26. Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
  27. Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
  28. Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
  29. Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
  30. Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
  31. Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
  32. Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
  33. Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).

Play Video

Cite This Article
Gupta, S. D., Song, D., Lee, S., Lee, J. W., Park, J., Prodromou, C., Pan, C. Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors. J. Vis. Exp. (191), e64693, doi:10.3791/64693 (2023).

View Video