Ensaio de Sedimentação à Base de Concanavalina A para Medir a Ligação ao Substrato de Fosfatases Glucanas
Summary
Este método descreve um ensaio de sedimentação in vitro baseado em lectina para quantificar a afinidade de ligação da fosfatase glucana e amilopectina. Este ensaio de co-sedimentação é confiável para medir a ligação do substrato glucana fosfatase e pode ser aplicado a vários substratos glucanos solubilizados.
Abstract
As fosfatases glucanas pertencem à maior família de fosfatases de dupla especificidade (DSP) que desfosforilam substratos glucanos, como glicogênio em animais e amido em plantas. As estruturas cristalinas da fosfatase glucana com substratos modelo de glucana revelam distintas interfaces de ligação glucanas feitas de DSP e domínios de ligação a carboidratos. No entanto, medidas quantitativas das interações glucano-glucana fosfatase com substratos fisiologicamente relevantes são fundamentais para o entendimento biológico da família de enzimas glucanas fosfatases e para a regulação do metabolismo energético. Este manuscrito relata um ensaio de sedimentação in vitro baseado em Concanavalina A () projetado para detectar a afinidade de ligação ao substrato das fosfatases glucanas contra diferentes substratos glucanos. Como prova de conceito, determinou-se a constante de dissociação (KD) da fosfatase de glucana Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) e amilopectina. A caracterização dos mutantes SEX4 e de outros membros da família de enzimas glucanas fosfatases demonstra ainda mais a utilidade deste ensaio para avaliar a ligação diferencial das interações proteína-carboidrato. Estes dados demonstram a adequação deste ensaio para caracterizar uma ampla gama de proteínas interagindo amido e glicogênio.
Introduction
As fosfatases glucanas são membros de uma subfamília funcionalmente diversa de fosfatases de dupla especificidade (DSPs) dentro dasuperfamília 1 da proteína tirosina fosfatase (PTP). Eles têm sido encontrados na maioria das formas de vida, incluindo organismos fotossintéticos amplamente divergentes, humanos, vertebrados e alguns invertebrados e protistas 2,3,4. As plantas contêm três fosfatases glucanas conhecidas: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) e Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Plantas que não possuem fosfatases glucanas apresentam taxas reduzidas de degradação transitória do amido e acúmulo de amido nas folhas 8,9. A laforina é o membro fundador da família das fosfatases glucanas, que desfosforila glicogênio em vertebrados e humanos 3,10. As mutações da laforina resultam em doença de Lafora neurodegenerativa, uma forma autossômica recessiva fatal de epilepsia11. As fosfatases glucanas são necessárias para o metabolismo do glicogênio e amido e têm emergido como enzimas importantes para a modulação do conteúdo de amido em plantas e tratamento da doença neurodegenerativa deLafora12,13. Estudos recentes de cristalografia de raios X em fosfatases de glucanas com substratos modelo de glucanas têm lançado luz sobre a ligação de substratos e o mecanismo catalítico da desfosforilação de glucanos14,15,16,17. No entanto, a compreensão atual de como as fosfatases glucanas se ligam a seus substratos fisiológicos é incompleta.
O amido é um polímero insolúvel de glicose à base de amilopectina a 80%-90% e amilose a 10%-20%18. Os substratos para as fosfatases glucanas vegetais são moléculas de carboidratos fosforilados, como glicogênio e grânulos de amido. Os resíduos de glucosil fosforilados estão presentes a uma razão fosfato:resíduo de glucosil de 1:600. Curiosamente, os fosfatos estão presentes apenas nas moléculas de amilopectina19. A principal planta glucana fosfatase SEX4 atua no grânulo de amido para desfosforilar moléculas de amilopectina. A estrutura cristalina de raios X do SEX4 combinada com estudos de mutagênese guiada por estrutura demonstrou as especificidades únicas do substrato do SEX4 para diferentes posições dentro de uma estrutura glucana15. Recentemente, demonstramos que a atividade biologicamente relevante do SEX4 só pode ser observada quando atua sobre seus substratos de amilopectina solubilizados20. No entanto, o entendimento das interações glucano-SEX4 tem se mostrado difícil devido à complexidade estrutural do substrato, especificidades de ligação mais amplas e baixas afinidades de ligação entre a proteína e seus substratos. Essas questões têm dificultado a capacidade de utilizar métodos comumente usados em interações proteína-ligante, tais como calorimetria de titulação isotérmica (ITC), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e ensaios baseados em ensaio imunoenzimático (ELISA).
Curiosamente, muito da nossa compreensão das interações carboidrato-proteína veio do estudo de lectinas. Concanavalina A () é uma leguminosa da família de proteínas extraídas originalmente do feijão-de-porco. O liga carboidratos com alta especificidade, o que é vantajoso para seu uso em aplicações de direcionamento e liberação de medicamentos. A ligação do a uma variedade de substratos contendo α-D-manosil e α-D-glicosil não redutores tem sido extensivamente estudada19,20. Esferas de Sepharose ligadas a comercialmente disponíveis são comumente usadas para purificar glicoproteínas e glicolipídios21. O liga-se a essas glucanas via grupos hidroxila C3, C4 e C6 dos resíduos de glicose. As esferas de-Sepharose também têm sido usadas com sucesso para medir a ligação das interações glicogênio-proteína e amido-proteína22,23. Neste estudo, usamos esferas-Sepharose para desenvolver um ensaio de ligação para medir as especificidades de ligação das interações fosfatase-amilopectina glucana.
Anteriormente, um ensaio de sedimentação baseado em foi empregado para avaliar a capacidade de ligação ao substrato da fosfatase glucana14,20,24. Neste estudo, a mesma estratégia foi usada para desenvolver um novo método para determinar a afinidade de ligação das interações glucano-glucana fosfatase e carboidrato. Este método também tem uma vantagem para investigar várias interações carboidrato-proteína solubilizadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo demonstra o desenvolvimento bem-sucedido de um novo ensaio de sedimentação in vitro que permite determinar a afinidade de ligação das interações glucano-glucana fosfatase. O projeto do ensaio aproveita a ligação específica da lectina aos glucanos através dos resíduos hidroxila de glicose para capturar indiretamente substratos de carboidratos solubilizados em esferas de Sepharose. Isso permite a separação de frações proteicas ligadas e não ligadas via centrifugação …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo prêmio da National Science Foundation MCB-2012074. Os autores agradecem ao Dr. Craig W. Vander Kooi, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade da Flórida, pelas valiosas discussões e apoio. Os autores também agradecem ao Dr. Matthew S. Gentry, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade da Flórida, por seu apoio. Gostaríamos de agradecer à Dra. Sara Lagalwar, presidente do programa de neurociência do Skidmore College, por nos permitir usar o scanner de blot de dígitos C LICOR para imagens de western blot.
Materials
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
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