Vi introducerer fire metoder til at evaluere nanopartiklers og nanostrukturerede overfladers antimikrobielle aktiviteter ved hjælp af in vitro-teknikker . Disse metoder kan tilpasses til at studere interaktionerne mellem forskellige nanopartikler og nanostrukturerede overflader med en bred vifte af mikrobielle arter.
De antimikrobielle aktiviteter af nanopartikler og nanostrukturerede overflader, såsom sølv, zinkoxid, titandioxid og magnesiumoxid, er tidligere blevet undersøgt i kliniske og miljømæssige omgivelser og i forbrugsvarer. Manglende konsistens i de anvendte forsøgsmetoder og materialer har imidlertid kulmineret i modstridende resultater, selv blandt undersøgelser af de samme nanostrukturtyper og bakteriearter. For forskere, der ønsker at anvende nanostrukturer som additiv eller belægning i et produktdesign, begrænser disse modstridende data deres udnyttelse i kliniske omgivelser.
For at konfrontere dette dilemma præsenterer vi i denne artikel fire forskellige metoder til at bestemme nanopartiklers og nanostrukturerede overfladers antimikrobielle aktiviteter og diskuterer deres anvendelighed i forskellige scenarier. Tilpasning af konsistente metoder forventes at føre til reproducerbare data, der kan sammenlignes på tværs af undersøgelser og implementeres for forskellige nanostrukturtyper og mikrobielle arter. Vi introducerer to metoder til at bestemme nanopartiklers antimikrobielle aktiviteter og to metoder til nanostrukturerede overfladers antimikrobielle aktiviteter.
For nanopartikler kan metoden med direkte samdyrkning anvendes til at bestemme de mindste hæmmende og minimale bakteriedræbende koncentrationer af nanopartikler, og dyrkningsmetoden med direkte eksponering kan anvendes til at vurdere bakteriostatisk versus bakteriedræbende aktivitet i realtid som følge af nanopartikeleksponering. For nanostrukturerede overflader anvendes metoden med direkte dyrkning til at bestemme levedygtigheden af bakterier, der indirekte og direkte er i kontakt med nanostrukturerede overflader, og metoden med fokuseret kontakteksponering anvendes til at undersøge antimikrobiel aktivitet på et bestemt område af en nanostruktureret overflade. Vi diskuterer vigtige eksperimentelle variabler, der skal overvejes til in vitro-undersøgelsesdesign , når de antimikrobielle egenskaber af nanopartikler og nanostrukturerede overflader bestemmes. Alle disse metoder er relativt billige, anvender teknikker, der er relativt lette at mestre og gentages for konsistens, og er anvendelige på en bred vifte af nanostrukturtyper og mikrobielle arter.
I USA alene udvikler 1,7 millioner individer en hospitalserhvervet infektion (HAI) årligt, hvor en ud af hver 17 af disse infektioner resulterer i død1. Derudover anslås det, at behandlingsomkostningerne for HAI’er varierer fra $ 28 milliarder til $ 45 milliarder årligt 1,2. Disse HAI’er domineres af methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA)3,4 og Pseudomonas aeruginosa4, som almindeligvis isoleres fra kroniske sårinfektioner og normalt kræver omfattende behandling og tid for at producere et gunstigt patientresultat.
I løbet af de sidste årtier er der udviklet flere antibiotikaklasser til behandling af infektioner relateret til disse og andre patogene bakterier. For eksempel er rifamycinanaloger blevet anvendt til behandling af MRSA, andre gram-positive og gram-negative infektioner og Mycobacterium spp. infektioner5. I 1990’erne, for effektivt at behandle et stigende antal M. tuberculosis-infektioner, blev yderligere lægemidler kombineret med rifamycinanaloger for at øge deres effektivitet. Imidlertid forbliver ca. 5% af M. tuberculosis-tilfældene resistente over forrifampicin5,6, og der er stigende bekymring for multiresistente bakterier7. I øjeblikket er brugen af antibiotika alene muligvis ikke tilstrækkelig til behandling af infektioner erhvervet i sundhedsvæsenet, og dette har fremkaldt en løbende søgning efter alternative antimikrobielle behandlingsformer1.
Tungmetaller, såsom sølv (Ag)8,9,10 og guld (Au)11, og keramik, såsom titandioxid (TiO 2)12 og zinkoxid (ZnO)13, i nanopartikel (NP) form (henholdsvis AgNP, AuNP, TiO2 NP og ZnONP) er blevetundersøgt for deres antimikrobielle aktiviteter og er blevet identificeret som potentielle antibiotikaalternativer. Derudover bioresorberbare materialer, såsom magnesiumlegeringer (Mg-legeringer)14,15,16, magnesiumoxidnanopartikler 17,18,19,20,21 og magnesiumhydroxidnanopartikler [henholdsvis nMgO og nMg(OH)2]22,23,24, er også blevet undersøgt. De tidligere antimikrobielle undersøgelser af nanopartikler anvendte imidlertid inkonsekvente materialer og forskningsmetoder, hvilket resulterede i data, der er vanskelige eller umulige at sammenligne og undertiden er modstridende i naturen18,19. For eksempel varierede den mindste hæmmende koncentration (MIC) og den minimale bakteriedræbende koncentration (MBC) af sølvnanopartikler signifikant i forskellige undersøgelser. Ipe et al.25 evaluerede de antibakterielle aktiviteter af AgNP’er med en gennemsnitlig partikelstørrelse på ~ 26 nm for at bestemme MIC’erne mod gram-positive og gram-negative bakterier. De identificerede MIC for P. aeruginosa, E. coli, S. aureus og MRSA var henholdsvis 2 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml og 10 μg/ml. I modsætning hertil evaluerede Parvekar et al.26 AgNP’er med en gennemsnitlig partikelstørrelse på 5 nm. I dette tilfælde viste AgNP MIC og en MBC på 0,625 mg / ml sig at være effektive mod S. aureus. Derudover evaluerede Loo et al.27 AgNP’er med en størrelse på 4,06 nm. Når E. coli blev eksponeret for disse nanopartikler, blev MIC og MBC rapporteret ved 7,8 μg/ml. Endelig undersøgte Ali et al.28 de antibakterielle egenskaber af sfæriske AgNP’er med en gennemsnitlig størrelse på 18 nm. Når P. aeruginosa, E. coli og MRSA blev udsat for disse nanopartikler, blev MIC identificeret ved henholdsvis 27 μg / ml, 36 μg / ml, 27 μg / ml og 36 μg / ml, og MBC blev identificeret ved henholdsvis 36 μg / ml, 42 μg / ml og 30 μg / ml.
Selvom nanopartiklers antibakterielle aktivitet er blevet grundigt undersøgt og rapporteret i de seneste årtier, er der ingen standard for de materialer og forskningsmetoder, der anvendes til at muliggøre direkte sammenligninger på tværs af undersøgelser. Af denne grund præsenterer vi to metoder, den direkte samkulturmetode (metode A) og den direkte eksponeringsmetode (metode B), til at karakterisere og sammenligne nanopartiklers antimikrobielle aktiviteter, samtidig med at materialerne og metoderne holdes konsistente.
Ud over nanopartikler er nanostrukturerede overflader også blevet undersøgt for antibakterielle aktiviteter. Disse omfatter kulstofbaserede materialer, såsom grafennanoark, kulstofnanorør og grafit29 samt rene Mg- og Mg-legeringer. Hvert af disse materialer har udvist mindst en antibakteriel mekanisme, herunder fysisk skade på cellemembraner af kulstofbaserede materialer og skade på metaboliske processer eller DNA gennem frigivelse af reaktive iltarter (ROS), når Mg nedbrydes. Når zink (Zn) og calcium (Ca) kombineres i dannelsen af Mg-legeringer, forbedres forfiningen af Mg-matrixkornstørrelsen, hvilket fører til en reduktion i bakteriel vedhæftning til substratoverflader sammenlignet med Mg-only-prøver14. For at demonstrere antibakteriel aktivitet præsenterer vi den direkte kulturmetode (metode C), som bestemmer bakteriel vedhæftning på og omkring nanostrukturerede materialer over tid gennem kvantificering af bakteriekolonidannende enheder (CFU’er) med direkte og indirekte overfladekontakt.
Nanostrukturernes geometri på overflader, herunder størrelse, form og orientering, kan påvirke materialernes bakteriedræbende aktiviteter. For eksempel fremstillede Lin et al.16 forskellige nanostrukturerede MgO-lag på overfladerne af Mg-substrater gennem anodisering og elektroforetisk aflejring (EPD). Efter en periode med eksponering for den nanostrukturerede overflade in vitro blev væksten af S. aureus væsentligt reduceret sammenlignet med ubehandlet Mg. Dette indikerede en større styrke af den nanostrukturerede overflade mod bakteriel vedhæftning versus den ubehandlede metalliske Mg-overflade. For at afsløre de forskellige mekanismer for de antibakterielle egenskaber ved forskellige nanostrukturerede overflader diskuteres en fokuseret kontakteksponeringsmetode (metode D), der bestemmer celle-overfladeinteraktionerne inden for interesseområdet, i denne artikel.
Formålet med denne artikel er at præsentere fire in vitro-metoder, der kan anvendes på forskellige nanopartikler, nanostrukturerede overflader og mikrobielle arter. Vi diskuterer vigtige overvejelser for hver metode for at producere konsistente, reproducerbare data til sammenlignelighed. Specifikt anvendes metoden med direkte samkultur17 og metoden med direkte eksponering til undersøgelse af nanopartiklers antimikrobielle egenskaber. Gennem den direkte co-kulturmetode kan de mindste hæmmende og minimale bakteriedræbende koncentrationer (henholdsvis MIC og MBC90-99,99) bestemmes for individuelle arter, og den mest potente koncentration (MPC) kan bestemmes for flere arter. Gennem metoden med direkte eksponering kan nanopartiklers bakteriostatiske eller bakteriedræbende virkninger ved minimale hæmmende koncentrationer karakteriseres ved realtidsaflæsninger af optisk densitet over tid. Direct Culture14-metoden er velegnet til at undersøge bakterier direkte og indirekte i kontakt med nanostrukturerede overflader. Endelig præsenteres metoden med fokuseret kontakteksponering16 for at undersøge den antibakterielle aktivitet af et specifikt område på en nanostruktureret overflade gennem direkte anvendelse af bakterier og karakterisering af bakterievækst ved celle-nanostrukturgrænsefladen. Denne metode er modificeret fra den japanske industristandard JIS Z 2801:200016 og har til formål at fokusere på mikrobe-overfladeinteraktioner og udelukke virkningerne af nedbrydning af bulkprøver i mikrobiel kultur på antimikrobielle aktiviteter.
Vi har præsenteret fire in vitro metoder (A-D) til at karakterisere nanopartiklers og nanostrukturerede overfladers antibakterielle aktiviteter. Mens hver af disse metoder kvantificerer bakterievækst og levedygtighed over tid som reaktion på nanomaterialer, findes der en vis variation i de metoder, der anvendes til at måle den oprindelige bakterielle såtæthed, vækst og levedygtighed over tid. Tre af disse metoder, metoden med direkte samkultur (A)17, metoden med direkte kultur (C)1…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne sætter pris på den økonomiske støtte fra US National Science Foundation (NSF CBET-pris 1512764 og NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, Udvalget for Research Seed Grant (Huinan Liu) og UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant tildelt Patricia Holt-Torres. Forfatterne sætter pris på den hjælp, der ydes af Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) ved UC-Riverside til brug af SEM / EDS og Dr. Perry Cheung til brug af XRD. Forfatterne vil også gerne takke Morgan Elizabeth Nator og Samhitha Tumkur for deres hjælp med eksperimenterne og dataanalyserne. Eventuelle meninger, resultater, konklusioner eller anbefalinger udtrykt i denne artikel er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis synspunkterne fra National Science Foundation eller National Institutes of Health.
1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
pH meter | VWR | SP70P | |
Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
Sonicator | VWR | 97043-936 | |
Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |