Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Оценка антимикробной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей in vitro

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64712
Automatic Translation
1, 3, 1,2,3
1Microbiology Graduate Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Materials Science & Engineering Program, University of California, Riverside

Summary

Мы представляем четыре метода оценки антимикробной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей с использованием методов in vitro . Эти методы могут быть адаптированы для изучения взаимодействия различных наночастиц и наноструктурированных поверхностей с широким спектром микробных видов.

Abstract

Антимикробная активность наночастиц и наноструктурированных поверхностей, таких как серебро, оксид цинка, диоксид титана и оксид магния, ранее изучалась в клинических и экологических условиях, а также в потребляемых пищевых продуктах. Однако отсутствие согласованности в используемых экспериментальных методах и материалах привело к противоречивым результатам, даже среди исследований одних и тех же типов наноструктур и видов бактерий. Для исследователей, которые хотят использовать наноструктуры в качестве добавки или покрытия в дизайне продукта, эти противоречивые данные ограничивают их использование в клинических условиях.

Чтобы противостоять этой дилемме, в этой статье мы представляем четыре различных метода определения антимикробной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей и обсуждаем их применимость в различных сценариях. Ожидается, что адаптация последовательных методов приведет к воспроизводимым данным, которые можно будет сравнивать в разных исследованиях и внедрять для различных типов наноструктур и видов микробов. Мы представляем два метода определения антимикробной активности наночастиц и два метода антимикробной активности наноструктурированных поверхностей.

Для наночастиц метод прямого совместного культивирования может быть использован для определения минимальных ингибирующих и минимальных бактерицидных концентраций наночастиц, а метод культивирования прямого воздействия может быть использован для оценки бактериостатической и бактерицидной активности в реальном времени, возникающей в результате воздействия наночастиц. Для наноструктурированных поверхностей метод прямого культивирования используется для определения жизнеспособности бактерий, косвенно и непосредственно контактирующих с наноструктурированными поверхностями, а метод воздействия с фокусированным контактом используется для изучения антимикробной активности на определенном участке наноструктурированной поверхности. Мы обсуждаем ключевые экспериментальные переменные, которые следует учитывать при дизайне исследования in vitro при определении антимикробных свойств наночастиц и наноструктурированных поверхностей. Все эти методы относительно недороги, используют методы, которые относительно просты в освоении и воспроизводимы для согласованности, и применимы к широкому спектру типов наноструктур и микробных видов.

Introduction

Только в США у 1,7 миллиона человек ежегодно развивается внутрибольничная инфекция (ИСМП), причем каждая 17-я из этих инфекций приводит к смерти1. Кроме того, по оценкам, затраты на лечение ИСМП варьируются от 28 до 45 миллиардов долларов в год 1,2. В этих ИСМП преобладают метициллин-резистентные золотистые стафилококки (MRSA)3,4 и Pseudomonas aeruginosa4, которые обычно выделяются из хронических раневых инфекций и обычно требуют обширного лечения и времени для получения благоприятного исхода для пациента.

За последние несколько десятилетий было разработано несколько классов антибиотиков для лечения инфекций, связанных с этими и другими патогенными бактериями. Например, аналоги рифамицина использовались для лечения MRSA, других грамположительных и грамотрицательных инфекций и инфекций Mycobacterium spp.5. В 1990-х годах для эффективного лечения растущего числа инфекций, вызванных M. tuberculosis, дополнительные препараты были объединены с аналогами рифамицина для повышения их эффективности. Тем не менее, примерно 5% случаев M. tuberculosis остаются устойчивыми крифампицину5,6, и растет обеспокоенность в отношении бактерий с множественной лекарственной устойчивостью7. В настоящее время использование одних только антибиотиков может быть недостаточным для лечения ИСМП, и это спровоцировало постоянный поиск альтернативных антимикробных методов лечения1.

Тяжелые металлы, такие как серебро (Ag)8,9,10 и золото (Au)11, а также керамика, такая как диоксид титана (TiO2)12 и оксид цинка (ZnO)13, в форме наночастиц (NP) (AgNP, AuNP, TiO2 NP и ZnONP соответственно)были исследованы на предмет их антимикробной активности и были идентифицированы как потенциальные альтернативы антибиотикам. Кроме того, биорезорбируемые материалы, такие как магниевые сплавы (сплавы Mg)14,15,16, наночастицы оксида магния 17,18,19,20,21 и наночастицы гидроксида магния [nMgO и nMg(OH)2, соответственно]22,23,24, также были изучены. Однако в предыдущих антимикробных исследованиях наночастиц использовались противоречивые материалы и методы исследования, в результате чего данные, которые трудно или невозможно сопоставить, а иногда и противоречивы по своей природе18,19. Например, минимальная ингибирующая концентрация (MIC) и минимальная бактерицидная концентрация (MBC) наночастиц серебра значительно варьировались в разных исследованиях. Ipe et al.25 оценили антибактериальную активность AgNP со средним размером частиц ~ 26 нм для определения МИК против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Идентифицированные MIC для P. aeruginosa, E. coli, S. aureus и MRSA составляли 2 мкг / мл, 5 мкг / мл, 10 мкг / мл и 10 мкг / мл соответственно. Напротив, Parvekar et al.26 оценили AgNP со средним размером частиц 5 нм. В этом случае было обнаружено, что AgNP MIC и MBC 0,625 мг / мл эффективны против S. aureus. Кроме того, Loo et al.27 оценили AgNP размером 4,06 нм. Когда E. coli подвергалась воздействию этих наночастиц, сообщалось, что MIC и MBC составляют 7,8 мкг / мл. Наконец, Ali et al.28 исследовали антибактериальные свойства сферических AgNP со средним размером 18 нм. Когда P. aeruginosa, E. coli и MRSA подвергались воздействию этих наночастиц, MIC был идентифицирован при 27 мкг / мл, 36 мкг / мл, 27 мкг / мл и 36 мкг / мл соответственно, а MBC был идентифицирован при 36 мкг / мл, 42 мкг / мл и 30 мкг / мл соответственно.

Несмотря на то, что антибактериальная активность наночастиц широко изучалась и освещалась в течение последних десятилетий, не существует стандарта для используемых материалов и методов исследования, позволяющих проводить прямые сравнения между исследованиями. По этой причине мы представляем два метода: метод прямого совместного культивирования (метод А) и метод прямого воздействия (метод Б), чтобы охарактеризовать и сравнить антимикробную активность наночастиц при сохранении согласованности материалов и методов.

В дополнение к наночастицам, наноструктурированные поверхности также были исследованы на антибактериальную активность. К ним относятся материалы на основе углерода, такие как графеновые нанолисты, углеродные нанотрубки и графит29, а также чистые сплавы Mg и Mg. Каждый из этих материалов проявляет по крайней мере один антибактериальный механизм, включая физическое повреждение, налагаемое на клеточные мембраны материалами на основе углерода, и повреждение метаболических процессов или ДНК посредством высвобождения активных форм кислорода (АФК) при разложении Mg. Кроме того, при объединении цинка (Zn) и кальция (Ca) при образовании сплавов Mg улучшается уточнение размера зерна матрицы Mg, что приводит к снижению адгезии бактерий к поверхностям подложки по сравнению с образцами14, содержащими только Mg. Чтобы продемонстрировать антибактериальную активность, мы представляем метод прямого культивирования (метод C), который определяет адгезию бактерий к наноструктурированным материалам и вокруг них с течением времени путем количественного определения бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ) с прямым и косвенным поверхностным контактом.

Геометрия наноструктур на поверхностях, включая размер, форму и ориентацию, может влиять на бактерицидную активность материалов. Например, Lin et al.16 изготовили различные наноструктурированные слои MgO на поверхностях подложек Mg путем анодирования и электрофоретического осаждения (EPD). После периода воздействия на наноструктурированную поверхность in vitro рост S. aureus был существенно снижен по сравнению с необработанным Mg. Это указывает на большую эффективность наноструктурированной поверхности против бактериальной адгезии по сравнению с необработанной металлической поверхностью Mg. Для выявления различных механизмов антибактериальных свойств различных наноструктурированных поверхностей в данной статье обсуждается метод сфокусированного контактного воздействия (метод D), определяющий взаимодействия клетки с поверхностью в пределах исследуемой области.

Целью данной статьи является представление четырех методов in vitro, применимых к различным наночастицам, наноструктурированным поверхностям и микробным видам. Мы обсудим ключевые соображения для каждого метода для получения согласованных, воспроизводимых данных для сопоставимости. В частности, метод прямого совместного культивирования17 и метод прямого воздействия используются для изучения антимикробных свойств наночастиц. С помощью метода прямого совместного культивирования минимальные ингибирующие и минимальные бактерицидные концентрации (MIC и MBC90-99,99 соответственно) могут быть определены для отдельных видов, а наиболее мощная концентрация (MPC) может быть определена для нескольких видов. С помощью метода прямого воздействия бактериостатические или бактерицидные эффекты наночастиц при минимальных ингибирующих концентрациях могут быть охарактеризованы показаниями оптической плотности в реальном времени с течением времени. Метод прямого культивирования14 пригоден для исследования бактерий, непосредственно и косвенно контактирующих с наноструктурированными поверхностями. Наконец, представлен метод16 фокусированного контактного воздействия для изучения антибактериальной активности конкретной области на наноструктурированной поверхности посредством прямого применения бактерий и характеристики роста бактерий на границе раздела клетка-наноструктура. Этот метод является модифицированным по сравнению с японским промышленным стандартом JIS Z 2801:200016 и предназначен для сосредоточения внимания на взаимодействии микробов с поверхностью и исключения влияния разложения объемного образца в микробной культуре на антимикробную активность.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Чтобы представить методы прямого совместного культивирования и прямого воздействия, мы используем наночастицы оксида магния (nMgO) в качестве модельного материала для демонстрации бактериальных взаимодействий. Для представления методов прямого культивирования и сфокусированного контактного воздействия в качестве примеров мы используем сплав магния с наноструктурированными поверхностями.

1. Стерилизация наноматериалов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все наноматериалы должны быть стерилизованы или продезинфицированы перед микробной культурой. Методы, которые могут быть использованы, включают тепло, давление, излучение и дезинфицирующие средства, но допуск материалов для каждого метода должен быть определен до экспериментов in vitro .

  1. Наночастицы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить в органическом растворителе, таком как этанол, или упаковывать в посуду или коробку с последующей стерилизацией или дезинфекцией соответствующим образом. Наночастицы стерилизовали с использованием следующего метода для демонстрации метода прямого совместного культивирования17 и метода прямого воздействия.
    1. Стерилизуйте наночастицы MgO в конвекционной печи с температурой 200 °C30 в течение 60 минут перед каждым экспериментом in vitro .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был выбран потому, что водяной пар и ультрафиолетовый свет могут влиять на структуры наночастиц MgO (nMgO)17.
  2. Сыпучие материалы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наноструктурированные материалы стерилизовали следующим методом для демонстрации метода прямого культивирования.
    1. Для метода прямого культивирования14 дезинфицируют подготовленные образцы ZC21, Mg и T64 с использованием ультрафиолетового (УФ) излучения в течение 4 часов перед началом исследований in vitro .
    2. Для метода16 фокусированного контактного воздействия дезинфицируют все образцы с помощью УФ-излучения в течение 2 ч до начала исследований in vitro .
  3. В качестве альтернативы используйте окись этилена (EtO) для стерилизации термочувствительных материалов.

2. Метод прямого совместного культивирования (метод А)

ПРИМЕЧАНИЕ: В методе А бактерии в посевной культуре с лаг-фазой непосредственно смешиваются с наночастицами определенных концентраций. Для изучения антимикробной активности наночастиц мы следуем протоколу, описанному Nguyen et al.17.

  1. Характеристика наночастиц и наноструктур
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав и форма наноструктуры подтверждены с помощью дифракции рентгеновского порошка.
    1. Измерение наночастиц
      1. Взвесьте наночастицы в 9 раз больше желаемой массы на мл, чтобы разместить образцы объемом 3 мл в трех экземплярах. Например, весить 0,2 мг/мл nMgO при 1,8 мг/мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает равномерное распределение наночастиц в бактериальных культурах и бульонах.
      2. Измерьте все наночастицы в микроцентрифужной пробирке объемом 5,0 мл, которая была предварительно взвешена и тарирована с помощью аналитических весов.
  2. Подготовка и выращивание бактериальных культур
    1. Для каждого эксперимента in vitro извлеките запасы клеток бактерий из хранилища при -80 ° C. Добавьте 10 мкл каждого запаса клеток бактерий в 5 мл подходящей питательной среды.
    2. Поместите инокулированную среду в инкубатор-шейкер при температуре 37 °C и 250 об/мин примерно на 16 часов в течение ночи.
      1. Если выращиваются виды стафилококка , субкультурируйте, помещая 400 мкл каждой ночной культуры в 20 мл свежей питательной среды (100 мкл / 5 мл среды) и инкубируйте с встряхиванием при 37 ° C и 250 об/мин в течение дополнительных 4-6 часов.
  3. Промывка и подсчет клеток бактерий для определения плотности посева
    ПРИМЕЧАНИЕ: Желаемая плотность посева 7,8 × 106 КОЕ/мл была идентифицирована как количество клеток, превышающее то, что требуется для подтверждения инфекции мочевыводящих путей.
    1. Соберите культивируемые бактерии, аликвотируя 1 мл ночной культуры бактерий в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Создайте достаточное количество аликвот из ночных бактериальных культур и центрифугируйте их в течение 10 мин при 1,956 × г , чтобы достичь желаемой плотности посева.
    2. После центрифугирования проводят пипетку, чтобы удалить надосадочную жидкость из гранулированных клеток и поместить надосадочную жидкость в емкость для сбора. Ресуспендируют клеточные гранулы в 0,5 мл свежей питательной среды. Объедините две суспензии по 0,5 мл, чтобы создать 1 мл суспензии, чтобы уменьшить количество аликвот 1 мл ресуспендированных клеток до шести. Повторить центрифугирование в течение 10 мин при дозе 1,956 × г.
    3. Завершите второй цикл промывки, используя свежую питательную среду, как показано на шаге 2.3.2, чтобы уменьшить количество 1 мл аликвот ресуспендированных промытых клеток до трех.
    4. Завершите третий цикл, как на этапе 2.3.2, за исключением ресуспендирования клеточных гранул в 0,33 мл трис-буфера (гидроксиметил)аминометанового буфера (трис-буфер, рН 8,5). Объедините три суспензии, каждая объемом 0,33 мл, в одну микроцентрифугу объемом 1,5 мл. Повторить центрифугирование в течение 10 мин при дозе 1,956 × г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трис-буфер не содержит ионов Mg 2+ или Ca2+ 31. Это важно для использования индуктивно-связанной плазменно-оптической эмиссионной спектрометрии (ICP-OES) для измерения ионов Mg 2+ и Ca2+ в посткультуральных бульонах. Напротив, фосфаты, присутствующие в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS)32, например, связывают ионы Mg 2+ или Ca2+ 33,34,35 и вызывают путаницу в интерпретации данных ICP-OES.
    5. Удалите надосадочную жидкость из гранулированных ячеек. Ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл свежего буфера Tris, известного как клеточная суспензия - бактериальная посевная культура с лаг-фазой.
    6. Определите концентрацию клеточной суспензии (клеток/мл) с помощью гемоцитометра.
  4. Создание посевной культуры бактерий
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец имеет общий объем 3 мл и заполняется в трех экземплярах (всего 9 мл).
    1. Определите общий объем бактерий, необходимых для посева культуры. Чтобы создать посевную культуру, используйте C 1V1 = C 2 V2, чтобы рассчитать объем клеточной суспензии, необходимый для создания посевной культуры, 7,8 × 106 клеток / мл. Расчетный объем клеточной суспензии (V1) прибавьте к требуемому объему питательных сред (V2).
    2. Определите фактическую плотность посева бактерий в КОЕ/мл. Создайте десятикратное серийное разведение до 10-4. Нанесите 10-4 разбавления на соответствующий ростовой агар и инкубируйте в течение ночи. После инкубации подсчитайте количество колоний и рассчитайте КОЕ/мл.
  5. Образование культур бактерий и наночастиц
    1. В 12-луночных полистирольных пластинах, не обработанных тканью, аликвот 2 мл бактериальной посевной культуры в каждую лунку для необходимого количества лунок.
    2. На каждую микроцентрифужную пробирку объемом 5 мл, содержащую предварительно взвешенный nMgO, добавляют 3 мл бактериальной посевной культуры. Кратковременно вихните, чтобы смешать nMgO с бактериями. Аликвотируйте 1 мл смеси в три отдельные лунки для создания тройных образцов каждой предварительно измеренной массы nMgO. Пипетка смесь бактерий / nMgO 2-3 раза перед каждым 1 мл аликвоты для поддержания nMgO в суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные образцы будут состоять только из 3 мл клеток, 3 мл только среды и 3 мл, содержащих самые низкие и самые высокие концентрации используемых наночастиц. Они подготовлены, как показано на шаге 2.5.2. Все контрольные образцы комплектуются в трех экземплярах.
    3. Инкубируйте все 12-луночные планшеты при 37 °C и 120 об/мин в течение 24 часов.
  6. Определение роста бактериальных клеток после воздействия nMgO
    1. После ночной инкубации бактериальных культур соберите каждые 3 мл образца путем пипетки в индивидуальную коническую пробирку объемом 15 мл.
    2. Используйте 96-луночную пластину для создания последовательных разведений 1:10. Определите количество колонок, необходимых для последовательного разведения всех образцов, содержащих бактерии. Добавьте 180 мкл буфера Tris в каждую лунку в строке B в строке G для соответствующего количества столбцов.
    3. Кратковременно встряхните каждую коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую бактериальные образцы, и добавьте 50 мкл в отдельную лунку в ряду А.
    4. Для каждой лунки в ряду А перенесите 20 мкл в ряд B (например, от A1 до B1) и кратковременно перемешайте пипеткой, чтобы получить объем 200 мкл. Используя стерильный наконечник пипетки, перенесите 20 мкл из лунки в ряду B в лунку в ряду C. Продолжайте эту схему до тех пор, пока лунка в ряду G не будет содержать 200 мкл, завершение последовательного разбавления от 10−1 в ряду В до 10−6 в ряду G.
    5. Нанесите по 100 мкл каждой лунки на соответствующую пластину с ростовым агаром и распределите по пластине, чтобы диспергировать клеточную культуру. Поместите тарелки в инкубатор-шейкер на ночь при температуре 37 °C. Выдерживают пластины при 37 °C в течение 24 часов.
    6. Изучите таблички и посчитайте те, которые имеют примерно 25-300 колоний. Если возможно, выбирайте пластины с одинаковым значением разбавления. Используйте количество колоний на планшете для расчета КОЕ/мл.
  7. Оценка рН после инкубации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя для каждой модели pH-метра.
    1. Предварительно откалибруйте рН-метр с помощью стандартизирующих растворов рН 4, рН 7 и рН 10. Считайте каждый бактериальный образец, поместив датчик pH в коническую пробирку объемом 15 мл.
  8. Подготовка проб для ИСП-ОЭС
    ПРИМЕЧАНИЕ: ICP-OES используется для определения концентрации ионов Mg 2+ и Ca2+. Эти катионы считаются важными, так как каждый из них участвует в клеточном метаболизме.
    1. Центрифугу каждую коническую пробирку объемом 15 мл, приготовленную на этапе 2.6.1, в течение 5 мин при 5,724 × г для гранулирования клеточного мусора и наночастиц.
    2. Используя коническую трубку объемом 15 мл, разбавьте 30 мкл надосадочной жидкости в 2,97 мл 18,2 Ω фильтрованной воды, чтобы получить разведение 1:100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разбавления может быть скорректирован на основе прогнозируемых концентраций ионов и предела обнаружения спектрометрического прибора.
    3. Ознакомьтесь с примерами с помощью ICP-OES.

3. Метод прямого воздействия (метод Б)

ПРИМЕЧАНИЕ: Если скорость роста выбранных бактерий неизвестна, то стандартизация кривой роста должна быть завершена до внедрения этого метода.

  1. Определите бактериостатическую и бактерицидную активность в реальном времени при воздействии интересующих наночастиц.
    1. Получают желаемые концентрации наночастиц с использованием способов, описанных в шаге 2.1-2.1.2.2. Подготовьте два набора каждой массы наночастиц для использования: один для добавления к 3 мл аликвот культуры бактерий в логарифмической фазе роста, а другой для добавления к 3 мл аликвот питательной среды без бактерий в качестве контрольных групп.
    2. Определите подходящие бактериостатические и бактерицидные антибиотики для тестируемых видов бактерий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется знание минимальной ингибирующей концентрации для каждого антибиотика.
  2. Рассчитайте общий объем бактериальной культуры, необходимый для трех образцов объемом 3 мл для всех образцов наночастиц, антибиотиков и контрольных образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется равный объем стерильной питательной среды. Если планируется использование спектрофотометрии, это требует корректировки общего объема, необходимого для размещения объема от 0,5 мл до 1,0 мл, необходимого для кювет.
  3. День 1: Для каждого эксперимента in vitro создайте ночные запасы, следуя шагу 2.2.1-2.2.2.
  4. День 2: Убедитесь, что настройки считывателя пластин могут вместить 96-луночную пластину с оптической плотностью 600 нм. Измерьте образцы в аликвотах 200 мкл с помощью 96-луночного планшета.
    1. Определяют начальную бактериальную культуру OD600 при 0,01-й плотности, используемой для начала начального инкубационного периода до добавления наночастиц и антибиотиков.
    2. Соберите ночную культуру бактерий из инкубатора-шейкера.
      1. Для каждого материала (например, предварительно измеренных наночастиц или антибиотиков), подлежащего испытанию, создайте отдельную бактериальную культуру с OD600 0,01. Используйте контейнер, достаточно большой, чтобы вместить необходимый объем клеточной культуры (например, стерилизованную колбу Эрленмейера или конические пробирки объемом 50 мл).
      2. Разбавляют ночные бактериальные образцы питательной средой, помещая три 200 мкл аликвот питательной среды в три лунки и три аликвоты бактериальной культуры по 200 мкл в дополнительные лунки (например, от A1 до A6).
      3. Поместите пластину с 96 лунками в считыватель пластин и отсканируйте ее.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Показания усредняются для каждой сканируемой скважины, чтобы получить среднее значение.
      4. Чтобы рассчитать плотность бактерий во взвешенном состоянии, усредните среднее значение для каждой лунки, содержащей образец в трех экземплярах.
      5. Чтобы определить оптическую плотность бактерий, вычтите среднее значение образца бульона из среднего бактериального значения.
      6. Если необходимо продолжать регулировать бактериальную суспензию, продолжайте добавлять бульон или бактериальную культуру на ночь по мере необходимости и повторяйте сканирование в считывателе планшетов по мере необходимости до тех пор, пока OD600 не будет достигнут приблизительно 0,01.
      7. Инкубировать при 37 °C при встряхивании при 150 об/мин до достижения логарифмического роста.
  5. Извлеките бактериальные культуры из шейкера инкубатора.
    1. Аликвота 3 мл бактериальной культуры OD600 0,01 в меченые конические пробирки объемом 15 мл для тестовых и контрольных образцов в трех экземплярах.
    2. Аликвот 200 мкл бактериальной культуры в три лунки 96-луночного планшета и измерьте образцы с помощью планшетного считывателя.
    3. Рассчитайте показания, как описано ранее на шаге 3.4.2.2 и этапе 3.4.2.6 - "показания -0,5 ч".
  6. Создание и измерение смесей бактерий и наночастиц
    1. Аликвотировать 3 мл стерильной питательной среды в равных количествах с бактериальными культурами в меченые конические пробирки по 15 мл для контрольных образцов (в трех экземплярах).
    2. Для приготовления суспензий бактерий / наночастиц и стерильных сред / суспензий наночастиц удалите 1 мл бактериальной культуры или среды из каждого тройного набора конических пробирок объемом 15 мл.
      1. Поместите аликвоты объемом 1 мл в центрифужную пробирку объемом 5 мл, содержащую предварительно измеренные наночастицы, и ненадолго перемешайте.
      2. Из центрифужной пробирки объемом 5 мл верните 1 мл аликвот суспензий бактерий/наночастиц или среды/наночастиц в коническую пробирку объемом 15 мл для однородного распределения наночастиц.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетируйте смесь бактерий и наночастиц 2x-3x перед тем, как каждая аликвота объемом 1 мл будет пипетирована, чтобы поддерживать наночастицы во взвешенном состоянии.
  7. Создание и измерение смесей бактерий и антибиотиков
    1. Для создания бактериальных/антибиотических культур аликвотируют 3 мл инкубированной бактериальной культуры в соответственно меченые конические пробирки объемом 15 мл.
    2. После того, как все образцы подготовлены, аликвотируйте 200 мкл каждого образца в отдельные лунки 96-луночного планшета.
    3. Поместите планшет(ы) в считыватель пластин и начните сканирование - показания «0 ч».
    4. Поместите конические пробирки объемом 15 мл с образцами в инкубатор-шейкер при температуре 37 °C и 150 об/мин. Запишите все данные, как описано ранее на шагах 3.4.2.2 и 3.4.2.6.
  8. Примерно через 15 минут после завершения показаний 0 ч повторите шаги, описанные в шагах 3.7.2-3.7.3 - показания «0,5 ч».
    1. По истечении установленных 0 ч повторяйте шаги, описанные в шаге 3.7.2-шаге 3.7.3 каждые 90 мин в течение шести циклов; Завершите за 9 ч.
    2. После завершения шестого цикла поместите образцы в инкубатор-шейкер еще на 15 ч при 37 °C и 150 об/мин. Повторите шаги, описанные в шагах 3.7.2-3.7.3, чтобы получить показания за 24 часа. Запишите все данные, как описано ранее на шагах 3.4.2.2 и 3.4.2.6.

4. Метод прямого культивирования (метод С)

ПРИМЕЧАНИЕ: В методе С бактерии в посевной культуре с лаг-фазой помещают непосредственно на наноструктурированные поверхности, представляющие интерес. Для изучения антимикробной активности наноструктур мы следуем протоколу, описанному Zhang et al.14. Чтобы продемонстрировать этот метод прямого культивирования, в качестве образцов использовали ZC21 (сплав Mg-Zn-Ca) и штифты Mg.

  1. Подготовка и выращивание бактериальных культур
    1. Для каждого эксперимента in vitro создайте запасы на ночь, следуя шагу 2.2.1-2.2.2.
  2. Промывка и подсчет бактерий для определения плотности посева
    ПРИМЕЧАНИЕ: Желаемая плотность посева 7,5 × 105 КОЕ/мл была идентифицирована как зарегистрированная концентрация клеток, вызывающая ортопедические инфекции14.
    1. Извлеките бактериальную культуру на ночь из инкубатора-шейкера.
    2. Вымойте и соберите бактерии, следуя шагам 2.3.2-2.3.2.3, но замените свежую среду пересмотренной смоделированной жидкостью организма (rSBF) для каждого этапа промывки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: rSBF представляет собой буферный раствор, который имитирует ионную концентрацию плазмы крови человека. Однако rSBF содержит только неорганические соединения и не содержит каких-либо биоорганических соединений, таких как белки. Чтобы решить эту проблему, эмбриональную бычью сыворотку (FBS) комбинируют с rSBF для моделирования состава крови человека, чтобы лучше имитировать естественное образование апатита в кальцинированных тканях в экспериментальных условиях36.
    3. Удалите надосадочную жидкость из гранулированных ячеек. Ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл rSBF с добавлением 10% FBS-клеточной суспензии.
    4. Определите концентрацию клеточной суспензии (клеток/мл) с помощью гемоцитометра. Разбавьте клеточную суспензию до концентрации 7,5 ×10,5 клеток/мл в rSBF с добавлением 10% FBS. Создайте посевную культуру, следуя шагу 2.4.1.
    5. Определите фактическую плотность посева, выполнив шаг 2.4.2.
  3. Распределите суспензию бактериальных клеток по образцам в культуральных лунках.
    1. Поместите как образцы, так и контрольные образцы в отдельные лунки 48-луночной полистирольной пластины, не обработанной тканью.
    2. Аликвота 0,75 мл клеточной суспензии в каждую лунку, содержащую образцы и контроль. Поместите 48-луночные пластины в инкубатор-шейкер на 24 часа при 37 °C, встряхивая при 120 об/мин.
  4. Характеристика бактериальной концентрации
    1. После 24 часов инкубации соберите образцы и поместите их в отдельные пробирки с маркировкой.
    2. Соберите по два образца из каждой группы и поместите их по отдельности в маркированные микроцентрифужные пробирки объемом 5,0 мл. Добавьте 2 мл rSBF в каждую пробирку.
    3. Поместите образцы, собранные на шаге 4.4.2, в ванну для обработки ультразвуком и обрабатывайте ультразвуком в течение 10 минут. После каждых 5 минут перемешивайте каждый образец в течение 5 с.
    4. Соберите rSBF, содержащий только что отделившиеся бактериальные клетки, и поместите суспензию в маркированную свежую микроцентрифужную пробирку.
  5. Серийные разведения и нанесение гальванического покрытия бактериями
    1. Последовательно разбавляют и наносят бактериальную суспензию, следуя этапу 2.6.2-2.6.6.
  6. Оцените рН питательных сред после инкубации, выполнив шаг 2.7.
  7. Подготовьте посткультуральную среду для ICP-OES, следуя методам, описанным в шаге 2.8.

5. Метод сфокусированного контактного воздействия (метод D)

ПРИМЕЧАНИЕ: В методе D бактерии на нитроцеллюлозной фильтровальной бумаге находятся в непосредственном контакте с интересующей областью на наноструктурированных поверхностях. Этот метод сводит к минимуму вмешательство деградации объемных образцов в бактериальных культурах с бактериальной активностью. Для изучения антимикробной активности наноповерхности мы следуем протоколу, описанному Lin et al.16.

  1. Следуйте процедурам, описанным в шаге 2.2.1-2.2.2.1, чтобы создать бактериальную посевную культуру. Подтвердите фактическую плотность посева, выполнив шаг 2.4.2.
  2. Подготовьте образцы размером 1 × 1 см2 в квадратной форме. Подготовьте все типы образцов в трех экземплярах. При необходимости поместите образцы на трехмерный (3D) держатель диаметром 15 мм и высотой 10 мм. Поместите образец и держатель в лунку из полистирольной пластины, не обработанной культурой ткани.
  3. Подготовьте стерилизованную нитроцеллюлозную бумагу, обрезав каждую до диаметра 1 см. Поместите подготовленную нитроцеллюлозную бумагу на агаровую пластину, содержащую соответствующую среду.
  4. Пипетка 50 мкл разбавленной бактериальной культуры на фильтровальную бумагу.
  5. Пипетка 50 мкл соответствующей среды на центр каждой поверхности образца.
  6. С помощью стерилизованного пинцета соберите нитроцеллюлозную бумагу с поверхности агара. Осторожно переверните нитроцеллюлозную бумагу и поместите ее на поверхность образца так, чтобы бактерии находились в контакте с 50 мкл среды и интересующей наноструктурированной поверхностью.
  7. Добавьте 1 мл буфера Tris в каждую лунку, содержащую образец, для поддержания влажности. Инкубируйте пластину из полистирольной скважины, содержащую все образцы, при температуре 37 °C в течение 24 часов.
  8. Соберите нитроцеллюлозную бумагу с каждой поверхности образца. Поместите каждый в 5 мл буфера Tris. Вихревая собранные образцы фильтровальной бумаги и наноповерхностного материала в течение 5 с.
  9. Обрабатывайте ультразвуком каждый образец в течение 10 минут. Вихрь в течение 5 с через 5 мин и снова через 10 мин.
  10. Соберите суспензию буфера Tris из всех образцов и поместите каждый объем в отдельные пробирки для сбора свежих продуктов.
  11. Серийно разбавляют и накрывают образцы в соответствии с этапом 2.6.2-2.6.6.

6. Посткультуральная характеристика бактерий и наноматериалов

  1. Исследование адгезии и морфологии бактерий с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
    1. После ночной инкубации добавьте 10% глутарового альдегида в каждую лунку 48-луночной пластины из полистирола, не обработанного тканью, до тех пор, пока образцы не будут полностью покрыты. Инкубируют образцы в течение 1 ч, чтобы зафиксировать бактериальные клетки.
    2. Аспирируйте глутаровый альдегид в мусорную бутылку и промойте все образцы 3 раза буферным раствором Tris, чтобы удалить неприлипшие бактерии.
    3. Обезвоживайте образцы, используя 30%, 75% и 100% этанол в течение 30 мин каждый16.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для сушки образцов рекомендуется использовать сушилку в критических точках. Сушка образцов на воздухе при комнатной температуре в течение 24 часов не является идеальной.
    4. Используйте проводящие клейкие ленты, такие как медные или углеродные ленты, чтобы закрепить образцы на заглушке SEM. Покройте поверхности образца напылением , чтобы обеспечить проводимость перед визуализацией (например, покройте планшеты Mg прилипшими бактериями под платиной/палладием (Pt/Pd) в течение 45 с при 20 мА16).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы покрытия, время обработки и рабочий ток могут варьироваться в зависимости от типа образца.
    5. Сделайте снимки бактерий на образцах с помощью SEM с соответствующим рабочим расстоянием и ускоряющим напряжением и с желаемым увеличением. Например, используйте СЭМ со вторичным электронным детектором для получения изображений на рабочем расстоянии 5 мм и ускоряющем напряжении10 кВ 16.
  2. Изучить морфологию поверхности образцов посткультурных наноматериалов с помощью СЭМ.
    1. Для наноматериалов промойте образцы с помощью буфера Tris 3x, чтобы удалить свободные бактерии, которые не прикреплены к образцу. Для наночастиц диспергируйте частицы в растворитель, который не влияет на свойства образца с помощью ультразвука, чтобы добиться лучшей дисперсии, когда это необходимо.
    2. Высушите образцы после процедуры стирки.
    3. Используйте углеродные или медные двусторонние клейкие ленты для приклеивания образцов к заглушке SEM.
    4. Перед получением изображения создайте проводящий поверхностный слой Pt/Pd с помощью напыляющего покрытия, как описано на шаге 6.1.4. Возьмите образцы изображений, как описано в шаге 6.1.5.
    5. Проанализируйте элементный состав поверхности с помощью EDS с соответствующим ускоряющим напряжением и при желаемом увеличении (например, при 10 кВ после выполнения СЭМ-анализа16).
  3. Флуоресцентная визуализация бактериальной адгезии
    1. Подготовьте образцы для визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии, предварительно промыв их буфером Tris 3x. Высушите образцы на воздухе при комнатной температуре.
    2. Окрашивают каждый образец флуоресцентным красителем тиофлавина Т 10 мкМ в соответствии с установленным протоколом37.
    3. Выполняйте флуоресцентную визуализацию бактериальной адгезии с помощью инвертированного микроскопа в сочетании с цифровой камерой устройства с электронно-умножающим зарядом и зарядовой связью.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Идентификация антибактериальной активности наночастиц оксида магния и наноструктурированных поверхностей была представлена с использованием четырех методов in vitro , которые применимы к различным типам материалов и микробным видам.

Метод А и метод В исследуют активность бактерий при воздействии наночастиц в фазе запаздывания (метод А) и логарифмической фазе (метод В) в течение 24 часов или дольше. Метод А дает результаты, касающиеся MIC и MBC, в то время как метод B определяет ингибирующее и бактерицидное действие наночастиц. Метод С исследует активность бактерий при прямом и косвенном контакте с наноструктурированными поверхностями, а метод D исследует активность бактерий на выбранной области границы раздела клетка-наноструктура в течение 24 часов или дольше.

Используемые методы описаны на рисунках 1 и 2, а их результаты представлены на рисунках 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Репрезентативные экспериментальные результаты, которые количественно оценивают антимикробную активность nMgO против грамотрицательных и грамположительных бактерий и дрожжей, можно увидеть на рисунке 3. Антибактериальную активность nMgO и nMg(OH)2 против MRSA можно увидеть на рисунке 4. Антибактериальную активность наноструктурированных поверхностей в отношении MRSA можно увидеть на рисунках 5 и 6. Наконец, антибактериальную активность магниевых сплавов в отношении кишечной палочки можно увидеть на рисунке 8B.

Используя метод А, можно определить МИК и МБК для бактерий, подвергшихся воздействию наночастиц, используя согласованные методы и материалы. Эта согласованность позволяет проводить сравнения между видами с использованием идентифицированных MBC для определения наиболее мощной концентрации тестируемых наночастиц. Кроме того, этот метод может быть применен и к другим классификациям микроорганизмов для сравнения МПК и минимальных летальных концентраций (МЛК17). Здесь стерилизованные наночастицы были предварительно измерены в количестве, позволяющем утроить каждую требуемую концентрацию. Эти наночастицы были суспендированы в запаздывающей посевной культуре монобактерий с плотностью 6 × 10 6-8 × 106 клеток/мл. Описанный способ суспендирования предварительно измеренных наночастиц с посевной культурой или бульоном успешно создал тройные образцы, которые были относительно гомологичны по распределению наночастиц, что может уменьшить отклонение КОЕ/мл в тройных образцах. Экспериментальный рабочий процесс для этого метода проиллюстрирован на рисунке 1A. Демонстрация антимикробного действия nMgO на грамотрицательные и грамположительные бактерии и Candida spp. с использованием метода А можно увидеть на рисунке 3. Здесь для этих видов были идентифицированы МПК 1,0 мг/мл nMgO для грамотрицательных Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, а также MBC 99,99 1,0 мг/мл и1,6 мг/мл nMgO соответственно (рис. 3А). Грамположительные S. epidermidis, S. aureus и MRSA продемонстрировали MIC 0,5 мг / мл, 0,7 мг / мл и 1,0 мг / мл nMgO соответственно. Значения MBC 99,99 1,6 мг / мл и 1,2 мг / мл nMgO были идентифицированы для S. epidermidis и S. aureus соответственно, в то время как MRSA не был снижен выше MBC90 (рис. 3B). У лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых Candida spp., C. albicans и C. albicans FR были идентифицированы MIC 1,2 мг / мл и 1,0 мг / мл nMgO соответственно. Напротив, nMgO продемонстрировал значения MIC 1,0 и 0,7 мг / мл для C. glabrata и C. glabrata ER соответственно. Кроме того, каждый вид Candida достигал MBC 90 0,7-1,2 мг/мл nMgO, но только C.glabrata ER был снижен до MBC 99,99 при1,2 мг/мл nMgO (рис. 3C). Кроме того, у большинства испытанных видов была определена идентификация наиболее мощной концентрации (ПДК) nMgO. ПДК указывает концентрацию наночастиц, которая наиболее эффективна в полимикробных сообществах17.

Метод В подвергает бактерии в фазе логарифмического роста воздействию наночастиц определенных концентраций, чтобы определить, являются ли наночастицы бактериостатическими (ингибирующими) или бактерицидными, с использованием МБК, идентифицированных в методе А. Этот метод использует измерения спектрофотометрии (OD600) в течение дискретных периодов времени для выявления изменений в росте бактерий в ответ на воздействие наночастиц. Кроме того, бактерии, подвергшиеся воздействию бактериостатических или бактерицидных антибиотиков, выращивают одновременно с бактериями, подвергшимися воздействию наночастиц, в отдельных лунках, чтобы обеспечить эталон при идентификации активности этих наночастиц. Используемые концентрации nMgO и nMg(OH)2 были получены из предыдущего исследования с использованием бактерий логарифмической фазы роста, подвергшихся воздействию nMgO и nMg(OH)2. Концентрации nMgO и nMg(OH)2 были определены с использованием эквивалентов мМ в диапазоне от 5 мМ до 50 мМ. Результаты показали, что nMgO был бактерицидным по отношению к MRSA при 30 мМ (1,2 мг / мл nMgO), в то время как nMg (OH) 2 был бактериостатическим при 50 мМ (2,9 мг / мл nMg (OH)2). Концентрации используемых антибиотиков были определены из литературы и подтверждены в наших собственных экспериментах. Экспериментальный рабочий процесс для этого метода проиллюстрирован на рисунке 1B. Репрезентативные результаты для метода B можно увидеть на рисунке 4. Здесь MRSA, не подвергшийся воздействию наночастиц, экспоненциально вырос до OD600 0,85. При воздействии 1,2 мг/мл nMgO и 6,25 мкг/мл триметоприма рост бактерий снижался до OD 600 0,18 (80,2% и 81,6% соответственно), а 2,9 мг/мл nMg(OH)2 снижал рост бактерий до OD600 0,25 (70,3%). Воздействие 1,0 мкл / мл ванкомицина привело к снижению роста MRSA на 99,99%, что позволяет предположить, что концентрации nMgO и nMg (OH) 2, используемые здесь, были бактериостатическими по активности.

Метод С исследует антибактериальную активность наноструктурированных поверхностей. Бактериальную культуру в лаг-фазе роста высевали непосредственно на наноструктурированную поверхность для измерения КОЕ с прямым контактом с поверхностью или без него. С помощью этого метода удалось определить поверхностное влияние на адгезию и жизнеспособность бактерий в условиях прямого контакта. Бактерии, находящиеся в непосредственном контакте с наноструктурированными поверхностями и в непрямом контакте (в культуральной суспензии), были собраны и количественно определены в КОЕ/мл для определения роста бактерий в каждом состоянии. Эти полученные данные могут быть полезны при последующих применениях наноструктурированных материалов на поверхностях для клинического использования, где желательно снижение бактериальной колонизации поверхностных структур. Экспериментальный рабочий процесс для этого метода проиллюстрирован на рисунке 2A. Репрезентативные результаты для метода C можно увидеть на рисунке 5. Здесь не было ингибирования роста бактерий при непрямом контакте. Однако бактериальная адгезия была снижена для всех субстратов, особенно для сплава ZC21, за которым следуют T64 (титан), магний, только стекло и сплав ZSr41 соответственно. Эти результаты показывают, что ZC21 обладает самой сильной антибактериальной активностью против адгезии и роста MRSA для всех протестированных образцов14.

Метод D исследует антибактериальную активность в выбранной области интереса на границе раздела клетка-наноструктура путем прямого размещения бактерий в фильтровальной бумаге на наноструктурированной поверхности. С помощью этого метода можно выявить корреляцию между антибактериальной активностью и свойствами поверхности, такими как химический состав поверхности, шероховатость и площадь наноструктурированной поверхности16. Экспериментальный рабочий процесс для этого метода проиллюстрирован на рисунке 2B. Репрезентативные результаты для метода D можно увидеть на рисунке 6. Здесь жизнеспособный S. aureus не был идентифицирован на образцах 1.9A, 1.9 AA и EPD или их парной фильтровальной бумаге. Однако воздействие образцов EPD после отжига (A-EPD) уменьшало рост бактерий до нескольких клеток на наноструктурированной поверхности и парной фильтровальной бумаге. Образец, содержащий магний (Mg), также не имел бактериального роста, но жизнеспособные бактерии были выделены из парной фильтровальной бумаги. Снижение роста S. aureus не наблюдалось с образцами титана и стекла или их парной фильтровальной бумагой16.

В дополнение к использованию описанных выше методов для определения антимикробной активности, СЭМ и флуоресцентная микроскопия могут быть использованы для характеристики морфологических изменений, происходящих в микроорганизмах после воздействия наночастиц и наноструктурированных материалов. Репрезентативные изображения SEM, показывающие постэкспозиционную грамотрицательную Escherichia coli, представлены на рисунке 7A, а изображения, показывающие постэкспозиционную грамположительную S. aureus, представлены на рисунке 7B. Используя метод визуализации SEM с 5000-кратным увеличением, можно было идентифицировать фенотипические изменения в E. coli, подвергшихся воздействию концентраций 0,5 мг / мл nMgO или выше17. Флуоресцентная микроскопия также может быть использована для характеристики морфологических изменений в микроорганизмах, но с потенциально меньшими затратами и большей доступностью, чем SEM. На рисунке 8 показаны репрезентативные флуоресцентные изображения E. coli, подвергшиеся воздействию наноструктурированного материала, MgY_O в течение 1 дня, 2 дня и 3 дня, а также эталонная кишечная палочка. Первоначально использовался только один вид бактерий, кишечная палочка. В будущем мы рассмотрим возможность воздействия на другие виды бактерий тех же материалов, представляющих интерес, чтобы получить более полное представление о бактериальных реакциях на воздействие MgY_O. В этих результатах отдельные клетки и колонии E. coli можно было рассматривать и визуализировать с помощью окрашивания тиофлавином Т и флуоресцентного микроскопа для качественного анализа антибактериальной активности MgY_O15.

Figure 1
Рисунок 1: Принципиальные диаграммы для определения наночастиц MIC или MBC90-99.99 и бактериостатической или бактерицидной активности в постконтактных клеточных культурах . (A) Метод прямого совместного культивирования17. (B) Метод прямого воздействия. Сокращения: КОЕ = колониеобразующие единицы; NPs = наночастицы; OD600 = оптическая плотность при 600 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Принципиальные диаграммы для определения роста бактерий при прямом и косвенном контакте и на границе раздела клетка-наноструктура наноструктурированных поверхностей. (А) Метод прямого культивирования14. (B) Метод фокусированного контактного воздействия16. Сокращения: КОЕ = колониеобразующие единицы; СЭМ = сканирующая электронная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Представление жизнеспособных бактерий и дрожжей, количественно определяемое по КОЕ/мл через 24 часа после воздействия 0-2,0 мг/мл nMgO. (A) КОЕ/мл грамотрицательных бактерий, включая E. coli и P. aeruginosa. (B) КОЕ/мл грамположительных бактерий, включая S. epidermidis, S. aureus и метициллин-резистентный S. aureus. (C) КОЕ/мл лекарственно-чувствительных C. albicans, лекарственно-устойчивых C. albicans FR, чувствительных к лекарственным средствам C. glabrata и лекарственно-устойчивых C. glabrata ER .Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (N = 9). *p ≤ 0,05, что значительно ниже, чем в группах при 0-0,7 мг/мл nMgO для соответствующей бактерии или дрожжей. ^p ≤ 0,05, что значительно ниже, чем в группах при 0-1 мг / мл nMgO для соответствующего микроорганизма. #p ≤ 0,05, что значительно ниже, чем в группах при 0-0,5 мг/мл nMgO для соответствующего микроорганизма. &p ≤ 0,05, что значительно ниже, чем в группах при 0-0,3 мг/мл nMgO для соответствующего микроорганизма17. Эта цифра изменена по сравнению с Nguyen et al.17. Сокращения: FR = флуконазол-резистентный; ER = устойчивый к эхинокандину; nMgO = наночастицы оксида магния; КОЕ = колониеобразующие единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Представление показаний оптической плотности (OD600), полученных в режиме реального времени для метициллин-резистентного золотистого стафилококка. Воздействие MRSA на 1,2 мг/мл nMgO, 2,9 мг/мл nMg(OH)2, 6,25 мкг/мл триметоприма и 1,0 мкг/мл ванкомицина в течение 24 ч. . ≤ 0,025: рост MRSA, подвергшихся воздействию 1,0 мкг/мл ванкомицина через 0,5 ч, значительно ниже, чем рост MRSA, подвергшихся воздействию 2,9 мг/мл Mg(OH)2 через 7,5 ч. ^p ≤ 0,025: рост MRSA, подвергшийся воздействию 1,0 мкг / мл ванкомицина через 24 часа после инокуляции, значительно ниже, чем рост MRSA, подвергшегося воздействию 2,9 мг / мл Mg (OH) 2 через 24 часа. Данные представлены в виде среднего ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Представление жизнеспособных метициллин-резистентных S. aureus, количественно определяемое КОЕ/мл через 24 часа после контакта с образцами и контрольной группой. Бактерии были посеяны с фактической плотностью 7,5 × 10,5 клеток/мл и подтверждены КОЕ/мл. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения, n = 3; *p < 0,05. Equation 1p < 0,05 по сравнению с КОЕ на образцах ZC21. Эта цифра была изменена из Zhang et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Репрезентативная количественная оценка по КОЕ/мл плотности бактериального посева через 24 часа после воздействия обработанных на поверхности образцов Mg 1,9 A, 1,9 AA, EPD и A-EPD, а также контрольных образцов Mg и Ti. Бактерии были посеяны с фактической плотностью 6 × 106 КОЕ / мл, как показано красной пунктирной линией. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения; n = 3. *p < 0,05. Сплошная черная линия указывает на результаты статистического анализа бактериальной плотности на поверхностях образцов. Синяя пунктирная линия указывает на результаты статистического анализа бактериальной плотности на фильтрах, покрывающих поверхности образца. Сокращения: КОЕ = колониеобразующие единицы; A-EPD = электрофоретическое осаждение после отжига; EPD = электрофоретическое осаждение перед отжигом; А = анодирование перед отжигом; АА = анодирование после отжига. Эта цифра была изменена по сравнению с Lin et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Репрезентативные СЭМ-изображения грамотрицательной кишечной палочки и грамположительного золотистого стафилококка, подвергшихся воздействию 0-1,2 мг/мл nMgO. (A) E. coli показала аналогичную морфологию при концентрации от 1,2 мг/мл до 2,0 мг/мл nMgO. По этой причине одно изображение в дозе 1,2 мг/мл показано как представитель кишечной палочки, подвергшейся воздействию более высоких концентраций nMgO. (B) S. aureus также показал аналогичную морфологию при дозе от 1,2 мг/мл до 2,0 мг/мл nMgO. По этой причине одно изображение в дозе 1,2 мг/мл показано как представитель S. aureus, подвергшийся воздействию более высоких концентраций nMgO17. Масштабные линейки = 5 мкм. nMgO = наночастицы оксида магния. Эта цифра была изменена по сравнению с Nguyen et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Репрезентативные флуоресцентные изображения кишечной палочки , прилипшие к субстратам с количественным определением через 1 день, 2 дня и 3 дня инкубации. (A) Флуоресцентные изображения E . coli , окрашенные 10 мкМ тиофлавином T. (B) Количественная оценка E. coli , подвергшихся воздействию материалов, представляющих интерес, с использованием клеток/мл. Не было бактериальной адгезии к MgY_O после 2 дней инкубации и снижения адгезии к MgY после 3 дней инкубации. Масштабная линейка = 10 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Lock et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представили четыре метода in vitro (A-D) для характеристики антибактериальной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей. В то время как каждый из этих методов количественно оценивает рост и жизнеспособность бактерий с течением времени в ответ на наноматериалы, существуют некоторые различия в методах, используемых для измерения начальной плотности, роста и жизнеспособности бактериального посева с течением времени. Три из этих методов, метод прямого совместного культивирования (A)17, метод прямого культивирования (C)14 и метод фокусированного контактного воздействия (D)16, количественно определяют рост и жизнеспособность бактерий после периода воздействия наноматериалов путем подсчета КОЕ на единицу объема. Для сравнения, метод прямого воздействия (B) количественно определяет рост бактерий с помощью дискретных измерений оптической плотности в реальном времени (OD600). Этот метод также может быть применен к методам прямого совместного культивирования, прямого культивирования и воздействия с фокусированным контактом, если существуют временные ограничения для количественной оценки КОЕ и/или для кинетических исследований требуется считывание плотности бактерий в реальном времени. Если эффективные антибиотики неизвестны для видов бактерий, подлежащих испытанию методом прямого воздействия, необходимо провести поиск литературы для определения правильных антибиотиков и их значений MIC, которые будут служить эталонами для групп наноматериалов. Подтверждение значений MIC может быть сделано путем заполнения кривой стандартизации, которая отображает взаимосвязь между данными спектрофотометрии и количественной оценкой колониеобразующих единиц в определенные моменты времени. Этот процесс коррелирует количество клеток, присутствующих в культуре в определенных точках, с соответствующей оптической плотностью. Кроме того, бактерии на запаздывающей стадии роста вводятся в наночастицы методом прямого совместного культивирования и наноструктурированные поверхности в методах прямого культивирования и воздействия с фокусированным контактом. Напротив, бактерии на логарифмической стадии роста вводятся в наночастицы методом прямого воздействия. Кроме того, плотность бактериального посева количественно определяется в виде клеток/мл в методе прямого совместного культивирования, методе прямого культивирования и методе воздействия с фокусированным контактом, тогда как оптическая плотность (OD600) бактерий измеряется для отслеживания роста в режиме реального времени в методе прямого воздействия.

Хотя каждый из этих методов похож по структуре, они также обладают уникальными характеристиками, позволяющими различать влияние наночастиц или наноструктурированных поверхностей на бактерии. Например, метод прямого совместного культивирования характеризует реакцию бактерий на увеличение предварительно измеренных концентраций наночастиц путем количественного определения КОЕ/мл (рис. 3). Этот метод генерирует минимальную ингибирующую и минимальную бактерицидную концентрацию (MIC и MBC) наночастиц для микробных видов, представляющих интерес, и, если исследуются несколько видов, наиболее мощную концентрацию (MPC) наночастиц17. Идентификация MIC, MBC90-99.99 и MPC имеет важное значение для применения наночастиц в последующих приложениях. Например, эти данные могут быть применены к исследованиям антибактериальной активности наночастиц in vivo при сохранении цитосовместимости, когда также были идентифицированы менее летальные концентрации. Напротив, метод прямого воздействия характеризует активность наночастиц как бактериостатическую или бактерицидную таким образом, который аналогичен классификации антибиотиков, где синергетические или нежелательные эффекты должны быть идентифицированы до использования в исследовательских или клинических условиях.

Характеристика антибактериальных соединений как бактериостатических или бактерицидных имеет отношение к клиническому применению и исследованиям in vitro и in vivo 38. По этой причине при разработке методов изучения этих характеристик должны быть выявлены любые негативные эффекты, которые могут повлиять на результаты. Здесь метод прямого воздействия классифицирует наночастицы как бактериостатические или бактерицидные для конкретных видов бактерий с использованием измерений оптической плотности в реальном времени на длине волны 600 нм (рис. 4). Бактерии в логарифмической фазе роста смешиваются с наночастицами на уровне MIC для создания бактерий и суспензий наночастиц. Эти суспензии незаметно измеряются в режиме реального времени, чтобы определить текущее воздействие воздействия наночастиц на бактерии. Для проверки полученных результатов одновременно выращенные бактерии в суспензии с бактериостатическими и бактерицидными антибиотиками выступают в качестве эталона для подтверждения скорости роста бактерий, подвергшихся воздействию наночастиц.

Включение наночастиц в биоинженерные, клинические и экологические науки может иметь далеко идущие возможности, но использование антибактериальных данных наночастиц для исследований in vitro и in vivo на наноструктурированных поверхностях является сложной задачей. По этой причине мы представили методы прямого культивирования и сфокусированного контактного воздействия для характеристики антибактериальной активности наноструктурированных поверхностей in vitro . Метод прямого культивирования исследует антибактериальные эффекты наноструктурированных поверхностей при непосредственном контакте бактерий с интересующими материалами14. Здесь бактерии, взвешенные в rSBF плюс 10% FBS, подвергаются воздействию наноструктурированных поверхностей с последующей количественной оценкой роста бактерий с течением времени для бактерий, находящихся в непосредственном контакте с поверхностью и в суспензии, окружающей интересующий материал (косвенный контакт) с использованием КОЕ/мл. Ранее экспериментальные результаты с использованием наноструктур магниевых сплавов (сплавы ZC21 и ZSr41) показали, что антибактериальная активность увеличивается, когда бактерии находятся в прямом контакте с наноструктурированными поверхностями по сравнению с непрямым контактом, когда бактерии остаются во взвешенном состоянии практически без контакта14 (рис. 5). Наконец, метод сфокусированного контакта характеризует антибактериальную активность на границе раздела бактерий и наноструктурированной поверхности16. Здесь мы исследовали оксид магния, анодированный или электрофоретически нанесенный на поверхность биорезорбируемого магниевого сплава, чтобы определить потенциальное нарушение бактериальной адгезии и образования биопленки с течением времени. Нарушение образования биопленки может иметь решающее значение для процессов заживления пациентов, поскольку биопленки, как правило, уклоняются от иммунных реакций хозяина и антибиотикотерапии39 и приводят к инфекциям, которые чрезвычайно трудно поддаются лечению.

Здесь мы представляем метод, адаптированный из японского промышленного стандарта JIS Z 2801:200016. Этот метод гарантирует, что бактерии прикрепляются к стерильной нитроцеллюлозной фильтровальной бумаге с последующим воздействием на фиксированную область наноструктурированной поверхности. Это ограничивает характеристику поверхностного воздействия на антибактериальную активность только областью испытаний. В репрезентативных результатах анодирование перед отжигом (1,9А), анодирование после отжига (1,9АА) и электрофоретическое осаждение перед отжигом (EPD) показали значительное влияние на снижение роста бактерий, а также их соответствующую фильтровальную бумагу по сравнению с контрольными образцами магния, титана и стекла. Электрофоретическое осаждение после отжига образцов (A-EPD) также было эффективным в снижении роста бактерий, но этот результат был менее значимым по сравнению с результатами, полученными для образцов 1.9A, 1.9AA и EPD16 (рис. 6).

Таким образом, каждый метод in vitro , представленный здесь, достаточно прост в освоении и включает в себя недорогие и легкодоступные материалы. Эти методы могут быть использованы для характеристики взаимодействия между широким спектром наноматериалов и микробных видов, представляющих интерес для исследователей. Понимание сходств и различий между этими методами необходимо для разработки оптимальных экспериментов для достижения целей исследования. Здесь научные знания, полученные с помощью этих методов in vitro , могут быть применены к последующим медицинским приложениям, где антибиотики должны быть ограничены или представлять собой неблагоприятный подход.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликт интересов у авторов отсутствует.

Acknowledgments

Авторы высоко ценят финансовую поддержку со стороны Национального научного фонда США (награда NSF CBET 1512764 и NSF PIRE 1545852), Национальных институтов здравоохранения (NIH NIDCR 1R03DE028631), стипендии Калифорнийского университета (UC) Regents Faculty Development Fellowship, гранта Комитета по исследованиям (Huinan Liu) и гранта программы наставничества для выпускников UC-Riverside, присужденного Патрисии Холт-Торрес. Авторы высоко ценят помощь, оказанную Центральным центром расширенной микроскопии и микроанализа (CFAMM) в Калифорнийском университете в Риверсайде в использовании SEM / EDS и доктором Перри Чунгом в использовании XRD. Авторы также хотели бы поблагодарить Морган Элизабет Натор и Самхиту Тумкур за их помощь в экспериментах и анализе данных. Любые мнения, выводы, заключения или рекомендации, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда или Национальных институтов здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Milipore Sigma Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven  MTI Corporation BPG-7082 https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer  Sigma-Aldrich  42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE Fisher Scientific 50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera  Hamamatsu C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes Fisher Scientific 14-959-49B
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G5882
Hemocytometer Brightline, Hausser Scientific 1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES) PerkinElmer 8000
Inverse microscope Nikon Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth Sigma Life Science  L3022
Luria Bertani Broth + agar Sigma Life Science  L2897
MacroTube 5.0   Benchmark Scientific C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles US Research Nanomaterials, Inc Stock #: US3310   M MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance Mettler Toledo MS105D
Nitrocellulose paper Fisherbrand 09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351172
Petri dish 100 mm VWR 470210-568
Petri dish, 15 mm Fisherbrand FB0875713A
pH meter VWR SP70P
Scanning electron microscopy (SEM) TESCAN  Vega3 SBH
Sonicator VWR 97043-936
Table top centrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Table top centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar MP 1010617
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
UV-Vis spectrophotometer  Tecan Infinite 200 PRO https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L VWR N/A
X-ray power defraction  Panalytical N/A PANalytical Empyrean Series 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
  2. O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
  3. Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
  4. Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
  5. Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
  6. Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
  7. Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
  8. Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
  9. Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
  10. Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
  11. Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
  12. Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
  13. Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
  14. Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
  15. Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
  16. Lin, J., Nguyen, N. -Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
  17. Nguyen, N. -Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
  18. Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
  19. He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
  20. Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
  21. Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
  22. Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
  23. Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
  24. Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
  25. Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
  26. Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
  27. Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
  28. Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
  29. Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
  30. MTI Corporation. 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx (2022).
  31. CHEBI. Tris (CHEBI:9754). , https://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do;?chebiId=CHEBI:9754 (2023).
  32. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
  33. Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
  34. Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
  35. Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
  36. Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
  37. Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
  38. Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
  39. Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).

Tags

Биоинженерия выпуск 194 антимикробные наночастицы наноструктурированные поверхности минимальная ингибирующая концентрация (MIC) минимальная бактерицидная концентрация (MBC) дозозависимая бактерия бактерии
Оценка антимикробной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holt-Torres, P. S., Chen, Y., Liu,… More

Holt-Torres, P. S., Chen, Y., Liu, H. H. Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro. J. Vis. Exp. (194), e64712, doi:10.3791/64712 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter