Utvärdering av antimikrobiella aktiviteter av nanopartiklar och nanostrukturerade ytor in vitro
Summary
Vi introducerar fyra metoder för att utvärdera den antimikrobiella aktiviteten hos nanopartiklar och nanostrukturerade ytor med hjälp av in vitro-tekniker . Dessa metoder kan anpassas för att studera interaktioner mellan olika nanopartiklar och nanostrukturerade ytor med ett brett spektrum av mikrobiella arter.
Abstract
De antimikrobiella aktiviteterna hos nanopartiklar och nanostrukturerade ytor, såsom silver, zinkoxid, titandioxid och magnesiumoxid, har tidigare undersökts i kliniska och miljömässiga miljöer och i förbrukningsbara livsmedelsprodukter. Bristen på konsekvens i de experimentella metoder och material som används har dock kulminerat i motstridiga resultat, även bland studier av samma nanostrukturtyper och bakteriearter. För forskare som vill använda nanostrukturer som tillsats eller beläggning i en produktdesign begränsar dessa motstridiga data deras användning i kliniska miljöer.
För att konfrontera detta dilemma presenterar vi i denna artikel fyra olika metoder för att bestämma de antimikrobiella aktiviteterna hos nanopartiklar och nanostrukturerade ytor och diskutera deras tillämplighet i olika scenarier. Anpassning av konsekventa metoder förväntas leda till reproducerbara data som kan jämföras mellan studier och implementeras för olika nanostrukturtyper och mikrobiella arter. Vi introducerar två metoder för att bestämma de antimikrobiella aktiviteterna hos nanopartiklar och två metoder för de antimikrobiella aktiviteterna hos nanostrukturerade ytor.
För nanopartiklar kan den direkta samodlingsmetoden användas för att bestämma de minsta hämmande och minsta bakteriedödande koncentrationerna av nanopartiklar, och den direkta exponeringsodlingsmetoden kan användas för att bedöma bakteriostatisk kontra bakteriedödande aktivitet i realtid till följd av exponering för nanopartiklar. För nanostrukturerade ytor används direktodlingsmetoden för att bestämma livskraften hos bakterier som indirekt och direkt kommer i kontakt med nanostrukturerade ytor, och exponeringsmetoden med fokuserad kontakt används för att undersöka antimikrobiell aktivitet på ett specifikt område på en nanostrukturerad yta. Vi diskuterar viktiga experimentella variabler att överväga för in vitro-studiedesign när man bestämmer de antimikrobiella egenskaperna hos nanopartiklar och nanostrukturerade ytor. Alla dessa metoder är relativt billiga, använder tekniker som är relativt lätta att behärska och repeterbara för konsistens och är tillämpliga på ett brett spektrum av nanostrukturtyper och mikrobiella arter.
Introduction
Bara i USA utvecklar 1,7 miljoner individer en sjukhusförvärvad infektion (VRI) årligen, med en av 17 av dessa infektioner som leder till dödsfall1. Dessutom uppskattas att behandlingskostnaderna för VRI varierar från 28 miljarder dollar till 45 miljarder dollar årligen 1,2. Dessa vårdrelaterade infektioner domineras av meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA)3,4 och Pseudomonas aeruginosa4, som vanligtvis isoleras från kroniska sårinfektioner och vanligtvis kräver omfattande behandling och tid för att ge ett gynnsamt patientresultat.
Under de senaste decennierna har flera antibiotikaklasser utvecklats för att behandla infektioner relaterade till dessa och andra patogena bakterier. Till exempel har rifamycinanaloger använts för att behandla MRSA, andra grampositiva och gramnegativa infektioner och Mycobacterium spp.-infektioner5. På 1990-talet, för att effektivt behandla ett ökande antal M. tuberculosis-infektioner, kombinerades ytterligare läkemedel med rifamycinanaloger för att öka deras effektivitet. Cirka 5% av M. tuberkulosfall förblir dock resistenta motrifampicin5,6, och det finns en ökande oro för multiresistenta bakterier7. För närvarande kanske användningen av enbart antibiotika inte är tillräcklig vid behandling av vårdrelaterade infektioner, och detta har lett till ett pågående sökande efter alternativa antimikrobiella behandlingar1.
Tungmetaller, såsom silver (Ag)8,9,10 och guld (Au)11, och keramik, såsom titandioxid (TiO2)12 och zinkoxid (ZnO)13, i nanopartikelform (NP) (AgNP, AuNP, TiO2NPrespektive ZnONP) har undersökts för deras antimikrobiella aktiviteter och har identifierats som potentiella antibiotikaalternativ. Dessutom bioresorberbara material, såsom magnesiumlegeringar (Mg-legeringar)14,15,16, magnesiumoxidnanopartiklar 17,18,19,20,21 och magnesiumhydroxidnanopartiklar [nMgO respektive nMg(OH)2]22,23,24, har också undersökts. De tidigare antimikrobiella studierna av nanopartiklar använde dock inkonsekventa material och forskningsmetoder, vilket resulterade i data som är svåra eller omöjliga att jämföra och ibland är motsägelsefulla till sin natur18,19. Till exempel varierade den minsta hämmande koncentrationen (MIC) och minsta bakteriedödande koncentrationen (MBC) av silvernanopartiklar signifikant i olika studier. Ipe et al.25 utvärderade de antibakteriella aktiviteterna hos AgNP med en genomsnittlig partikelstorlek på ~ 26 nm för att bestämma MIC: erna mot grampositiva och gramnegativa bakterier. De identifierade MIC-värdena för P. aeruginosa, E. coli, S. aureus och MRSA var 2 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml respektive 10 μg/ml. Däremot utvärderade Parvekar et al.26 AgNP med en genomsnittlig partikelstorlek på 5 nm. I detta fall befanns AgNP MIC och en MBC på 0,625 mg / ml vara effektiva mot S. aureus. Dessutom utvärderade Loo et al.27 AgNPs med en storlek på 4,06 nm. När E. coli exponerades för dessa nanopartiklar rapporterades MIC och MBC vid 7,8 μg/ml. Slutligen undersökte Ali et al.28 de antibakteriella egenskaperna hos sfäriska AgNP med en genomsnittlig storlek på 18 nm. När P. aeruginosa, E. coli och MRSA exponerades för dessa nanopartiklar identifierades MIC vid 27 μg/ml, 36 μg/ml, 27 μg/ml respektive 36 μg/ml, och MBC identifierades vid 36 μg/ml, 42 μg/ml respektive 30 μg/ml.
Även om nanopartiklarnas antibakteriella aktivitet har studerats och rapporterats i stor utsträckning under de senaste decennierna finns det ingen standard för de material och forskningsmetoder som används för att möjliggöra direkta jämförelser mellan studier. Av denna anledning presenterar vi två metoder, den direkta samodlingsmetoden (metod A) och den direkta exponeringsmetoden (metod B), för att karakterisera och jämföra nanopartiklarnas antimikrobiella aktiviteter samtidigt som material och metoder hålls konsekventa.
Förutom nanopartiklar har nanostrukturerade ytor också undersökts för antibakteriella aktiviteter. Dessa inkluderar kolbaserade material, såsom grafennanoark, kolnanorör och grafit29, såväl som rena Mg- och Mg-legeringar. Var och en av dessa material har uppvisat minst en antibakteriell mekanism, inklusive fysisk skada på cellmembran av kolbaserade material och skador på metaboliska processer eller DNA genom frisättning av reaktiva syreradikaler (ROS) när Mg bryts ned. Dessutom, när zink (Zn) och kalcium (Ca) kombineras vid bildandet av Mg-legeringar, förbättras förfiningen av Mg-matriskornstorleken, vilket leder till en minskning av bakteriell vidhäftning till substratytor jämfört med endast Mg-prover14. För att demonstrera antibakteriell aktivitet presenterar vi direktodlingsmetoden (metod C), som bestämmer bakteriell vidhäftning på och runt nanostrukturerade material över tid genom kvantifiering av bakteriella kolonibildande enheter (CFU) med direkt och indirekt ytkontakt.
Geometrin hos nanostrukturer på ytor, inklusive storlek, form och orientering, kan påverka materialens bakteriedödande aktiviteter. Till exempel tillverkade Lin et al.16 olika nanostrukturerade MgO-lager på ytorna av Mg-substrat genom anodisering och elektroforetisk deponering (EPD). Efter en period av exponering för den nanostrukturerade ytan in vitro minskade tillväxten av S. aureus avsevärt jämfört med obehandlad Mg. Detta indikerade en större styrka hos den nanostrukturerade ytan mot bakteriell vidhäftning jämfört med den obehandlade metalliska Mg-ytan. För att avslöja de olika mekanismerna för antibakteriella egenskaper hos olika nanostrukturerade ytor diskuteras i denna artikel en fokuserad kontaktexponeringsmetod (metod D) som bestämmer cell-yteinteraktionerna inom intresseområdet.
Syftet med denna artikel är att presentera fyra in vitro-metoder som är tillämpliga på olika nanopartiklar, nanostrukturerade ytor och mikrobiella arter. Vi diskuterar viktiga överväganden för varje metod för att producera konsekventa, reproducerbara data för jämförbarhet. Specifikt används den direkta samodlingsmetoden17 och den direkta exponeringsmetoden för att undersöka nanopartiklarnas antimikrobiella egenskaper. Genom den direkta samodlingsmetoden kan de minsta hämmande och minsta bakteriedödande koncentrationerna (MIC respektive MBC90-99,99) bestämmas för enskilda arter, och den mest potenta koncentrationen (MPC) kan bestämmas för flera arter. Genom den direkta exponeringsmetoden kan de bakteriostatiska eller bakteriedödande effekterna av nanopartiklar vid minimala hämmande koncentrationer karakteriseras av optiska densitetsavläsningar i realtid över tiden. Direktkultur14-metoden är lämplig för att undersöka bakterier direkt och indirekt i kontakt med nanostrukturerade ytor. Slutligen presenteras metoden med fokuserad kontaktexponering16 för att undersöka den antibakteriella aktiviteten hos ett specifikt område på en nanostrukturerad yta genom direkt applicering av bakterier och karakterisering av bakterietillväxt vid cell-nanostrukturgränssnittet. Denna metod är modifierad från den japanska industristandarden JIS Z 2801: 200016 och är avsedd att fokusera på mikrob-ytinteraktioner och utesluta effekterna av bulkprovnedbrytning i mikrobiell kultur på antimikrobiella aktiviteter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har presenterat fyra in vitro-metoder (A-D) för att karakterisera de antibakteriella aktiviteterna hos nanopartiklar och nanostrukturerade ytor. Medan var och en av dessa metoder kvantifierar bakterietillväxt och livskraft över tid som svar på nanomaterial, finns det en viss variation i de metoder som används för att mäta den initiala bakteriella sådddensiteten, tillväxten och livskraften över tiden. Tre av dessa metoder, den direkta samodlingsmetoden (A)17, direktodlingsmeto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna uppskattar det ekonomiska stödet från US National Science Foundation (NSF CBET award 1512764 och NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) och UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant som tilldelats Patricia Holt-Torres. Författarna uppskattar hjälpen från Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) vid UC-Riverside för användning av SEM / EDS och Dr. Perry Cheung för användning av XRD. Författarna vill också tacka Morgan Elizabeth Nator och Samhitha Tumkur för deras hjälp med experimenten och dataanalyserna. Alla åsikter, resultat, slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i denna artikel är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis åsikterna från National Science Foundation eller National Institutes of Health.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
| 80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
| (hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
| AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
| Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
| Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
| Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
| Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
| Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
| MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
| Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
| MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
| Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
| Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
| Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
| Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
| Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
| Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
| pH meter | VWR | SP70P | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
| Sonicator | VWR | 97043-936 | |
| Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
| VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
| X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |
References
- Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections – An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
- O’Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
- Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
- Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
- Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
- Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
- Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
- Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
- Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
- Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
- Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
- Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
- Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
- Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
- Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
- Lin, J., Nguyen, N. -. Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
- Nguyen, N. -. Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
- Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
- He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
- Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
- Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
- Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
- Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
- Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
- Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
- Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
- Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
- Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
- Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
- MTI Corporation. . 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18″x16″x18″, 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) – BPG-7082. , (2022).
- CHEBI. . Tris (CHEBI:9754). , (2023).
- . Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
- Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
- Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
- Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions – Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
- Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
- Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
- Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
- Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).
