Evaluering av antimikrobielle aktiviteter av nanopartikler og nanostrukturerte overflater in vitro

Summary

Vi introduserer fire metoder for å evaluere de antimikrobielle aktivitetene til nanopartikler og nanostrukturerte overflater ved hjelp av in vitro-teknikker . Disse metodene kan tilpasses for å studere samspillet mellom forskjellige nanopartikler og nanostrukturerte overflater med et bredt spekter av mikrobielle arter.

Abstract

De antimikrobielle aktivitetene til nanopartikler og nanostrukturerte overflater, som sølv, sinkoksid, titandioksid og magnesiumoksid, har blitt utforsket tidligere i kliniske og miljømessige innstillinger og i forbruksvarer. Imidlertid har mangel på konsistens i eksperimentelle metoder og materialer som brukes kulminert i motstridende resultater, selv blant studier av de samme nanostrukturtyper og bakteriearter. For forskere som ønsker å bruke nanostrukturer som tilsetningsstoff eller belegg i et produktdesign, begrenser disse motstridende dataene bruken i kliniske omgivelser.

For å konfrontere dette dilemmaet, presenterer vi i denne artikkelen fire forskjellige metoder for å bestemme antimikrobielle aktiviteter av nanopartikler og nanostrukturerte overflater, og diskutere deres anvendelighet i forskjellige scenarier. Tilpasning av konsistente metoder forventes å føre til reproduserbare data som kan sammenlignes på tvers av studier og implementeres for forskjellige nanostrukturtyper og mikrobielle arter. Vi introduserer to metoder for å bestemme de antimikrobielle aktivitetene til nanopartikler og to metoder for antimikrobielle aktiviteter av nanostrukturerte overflater.

For nanopartikler kan den direkte samkulturmetoden brukes til å bestemme minimumshemmende og minimum bakteriedrepende konsentrasjoner av nanopartikler, og metoden for direkte eksponeringskultur kan brukes til å vurdere bakteriostatisk versus bakteriedrepende aktivitet i sanntid som følge av nanopartikkeleksponering. For nanostrukturerte overflater brukes den direkte kulturmetoden til å bestemme levedyktigheten til bakterier indirekte og direkte i kontakt med nanostrukturerte overflater, og eksponeringsmetoden for fokusert kontakt brukes til å undersøke antimikrobiell aktivitet på et bestemt område av en nanostrukturert overflate. Vi diskuterer viktige eksperimentelle variabler å vurdere for in vitro studiedesign ved bestemmelse av antimikrobielle egenskaper av nanopartikler og nanostrukturerte overflater. Alle disse metodene er relativt lave kostnader, benytter teknikker som er relativt enkle å mestre og repeterbare for konsistens, og gjelder for et bredt spekter av nanostrukturtyper og mikrobielle arter.

Introduction

Bare i USA utvikler 1,7 millioner individer en sykehuservervet infeksjon (HAI) årlig, med en av hver 17 av disse infeksjonene som resulterer i død¹. I tillegg er det anslått at behandlingskostnadene for HAIs varierer fra $ 28 milliarder til $ 45 milliarder årlig ^1,2. Disse HAIene domineres av meticillinresistente gule stafylokokker (MRSA)^3,4 og Pseudomonas aeruginosa^4, som vanligvis isoleres fra kroniske sårinfeksjoner og vanligvis krever omfattende behandling og tid for å gi et gunstig pasientutfall.

I løpet av de siste tiårene har flere antibiotikaklasser blitt utviklet for å behandle infeksjoner relatert til disse og andre patogene bakterier. For eksempel har rifamycinanaloger blitt brukt til å behandle MRSA, andre gram-positive og gram-negative infeksjoner, og Mycobacterium spp. infeksjoner⁵. På 1990-tallet, for effektivt å behandle et økende antall M. tuberculosis-infeksjoner, ble flere stoffer kombinert med rifamycinanaloger for å øke effektiviteten. Imidlertid forblir omtrent 5% av M. tuberculosis-tilfellene resistente motrifampicin^5,6, og det er økende bekymring for multiresistente bakterier⁷. For tiden kan bruk av antibiotika alene ikke være tilstrekkelig i behandlingen av HAIs, og dette har provosert et pågående søk etter alternative antimikrobielle terapier¹.

Tungmetaller, som sølv (Ag) 8,9,10 og gull (Au) 11, og keramikk, som titandioksid (TiO 2) 12 og sinkoksid (ZnO) ¹³, i nanopartikkel (NP) form (AgNP, AuNP, TiO₂ NP og ZnONP, henholdsvis) har blitt undersøkt for deres antimikrobielle aktiviteter og har blitt identifisert som potensielle antibiotikaalternativer. I tillegg bioresorberbare materialer, som magnesiumlegeringer (Mg legeringer)14,15,16, magnesiumoksid nanopartikler 17,18,19,20,21 og magnesiumhydroksid nanopartikler [nMgO og nMg(OH)₂, henholdsvis] ^22,23,24, har også blitt undersøkt. Imidlertid brukte de tidligere antimikrobielle studiene av nanopartikler inkonsistente materialer og forskningsmetoder, noe som resulterte i data som er vanskelige eller umulige å sammenligne og noen ganger motstridende i naturen^18,19. For eksempel varierte den minste hemmende konsentrasjonen (MIC) og minimum bakteriedrepende konsentrasjon (MBC) av sølvnanopartikler betydelig i forskjellige studier. Ipe et al.25 evaluerte de antibakterielle aktivitetene til AgNPs med en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på ~ ²⁶ nm for å bestemme MICs mot gram-positive og gram-negative bakterier. De identifiserte mikrofonene for P. aeruginosa, E. coli, S. aureus og MRSA var henholdsvis 2 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml og 10 μg/ml. I motsetning til dette evaluerte Parvekar et ^al.26 AgNPs med en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på 5 nm. I dette tilfellet ble AgNP MIC og en MBC på 0,625 mg / ml funnet å være effektive mot S. aureus. I tillegg evaluerte Loo et ^al.27 AgNPs med en størrelse på 4, 06 nm. Når E. coli ble utsatt for disse nanopartiklene, ble MIC og MBC rapportert ved 7, 8 μg / ml. Endelig undersøkte Ali et ^al.28 de antibakterielle egenskapene til sfæriske AgNPs med en gjennomsnittlig størrelse på 18 nm. Når P. aeruginosa, E. coli og MRSA ble utsatt for disse nanopartiklene, ble MIC identifisert ved henholdsvis 27 μg / ml, 36 μg / ml, 27 μg / ml og 36 μg / ml, og MBC ble identifisert ved henholdsvis 36 μg / ml, 42 μg / ml og 30 μg / ml.

Selv om den antibakterielle aktiviteten til nanopartikler har blitt grundig studert og rapportert de siste tiårene, er det ingen standard for materialene og forskningsmetodene som brukes til å tillate direkte sammenligninger på tvers av studier. Av denne grunn presenterer vi to metoder, den direkte samkulturmetoden (metode A) og den direkte eksponeringsmetoden (metode B), for å karakterisere og sammenligne de antimikrobielle aktivitetene til nanopartikler samtidig som materialene og metodene holdes konsistente.

I tillegg til nanopartikler har nanostrukturerte overflater også blitt undersøkt for antibakterielle aktiviteter. Disse inkluderer karbonbaserte materialer, som grafen nanoark, karbonnanorør og grafitt²⁹, samt rene Mg og Mg legeringer. Hvert av disse materialene har vist minst en antibakteriell mekanisme, inkludert fysisk skade påført cellemembraner av karbonbaserte materialer og skade på metabolske prosesser eller DNA gjennom frigjøring av reaktive oksygenarter (ROS) når Mg nedbrytes. I tillegg, når sink (Zn) og kalsium (Ca) kombineres i dannelsen av Mg-legeringer, forbedres forfiningen av Mg-matrikskornstørrelsen, noe som fører til en reduksjon i bakteriell adhesjon til substratoverflater i forhold til Mg-only-prøver¹⁴. For å demonstrere antibakteriell aktivitet presenterer vi den direkte dyrkningsmetoden (metode C), som bestemmer bakteriell adhesjon på og rundt nanostrukturerte materialer over tid gjennom kvantifisering av bakteriekolonidannende enheter (CFU) med direkte og indirekte overflatekontakt.

Geometrien til nanostrukturer på overflater, inkludert størrelse, form og orientering, kan påvirke materialets bakteriedrepende aktiviteter. For eksempel fremstilte Lin et ^al.16 forskjellige nanostrukturerte MgO-lag på overflatene av Mg-substrater gjennom anodisering og elektroforetisk avsetning (EPD). Etter en periode med eksponering for nanostrukturert overflate in vitro ble veksten av S. aureus betydelig redusert sammenlignet med ikke-behandlet Mg. Dette indikerte en større styrke av den nanostrukturerte overflaten mot bakteriell adhesjon versus den ubehandlede metalliske Mg-overflaten. For å avsløre de forskjellige mekanismene til de antibakterielle egenskapene til forskjellige nanostrukturerte overflater, diskuteres en fokusert-kontakteksponeringsmetode (metode D) som bestemmer celleoverflateinteraksjonene innenfor interesseområdet i denne artikkelen.

Målet med denne artikkelen er å presentere fire in vitro-metoder som kan brukes på forskjellige nanopartikler, nanostrukturerte overflater og mikrobielle arter. Vi diskuterer viktige hensyn for hver metode for å produsere konsistente, reproduserbare data for sammenlignbarhet. Spesielt brukes den direkte samkulturmetoden¹⁷ og direkte eksponeringsmetoden for å undersøke de antimikrobielle egenskapene til nanopartikler. Gjennom den direkte samkulturmetoden kan minste hemmende og minste bakteriedrepende konsentrasjoner (henholdsvis MIC og MBC_90-99.99) bestemmes for individuelle arter, og den mest potente konsentrasjonen (MPC) kan bestemmes for flere arter_. Gjennom den direkte eksponeringsmetoden kan de bakteriostatiske eller bakteriedrepende effektene av nanopartikler ved minimumshemmende konsentrasjoner karakteriseres ved sanntids optiske tetthetsavlesninger over tid. Direct culture^14-metoden er egnet for å undersøke bakterier direkte og indirekte i kontakt med nanostrukturerte overflater. Til slutt presenteres metoden med fokusert kontakt^{eksponering 16} for å undersøke den antibakterielle aktiviteten til et bestemt område på en nanostrukturert overflate gjennom direkte påføring av bakterier og karakterisering av bakterievekst ved celle-nanostrukturgrensesnittet. Denne metoden er modifisert fra den japanske industristandarden JIS Z 2801: 2000¹⁶, og er ment å fokusere på mikrobe-overflate-interaksjoner og utelukke effekten av nedbrytning av bulkprøver i mikrobiell kultur på antimikrobielle aktiviteter.

Protocol

For å presentere direkte samkultur og direkte eksponeringsmetoder bruker vi magnesiumoksid nanopartikler (nMgO) som et modellmateriale for å demonstrere bakterielle interaksjoner. For å presentere eksponeringsmetodene for direkte kultur og fokusert kontakt, bruker vi en Mg-legering med nanostrukturerte overflater som eksempler. 1. Sterilisering av nanomaterialer MERK: Alle nanomaterialer må steriliseres eller desinfiseres før mikrobiell dyrkning….

Representative Results

Identifiseringen av den antibakterielle aktiviteten til magnesiumoksid nanopartikler og nanostrukturerte overflater har blitt presentert ved hjelp av fire in vitro-metoder som er anvendelige på tvers av forskjellige materialtyper og mikrobielle arter. Metode A og metode B undersøker bakterieaktivitet når de utsettes for nanopartikler i en lagfase (metode A) og loggfase (metode B) i en varighet på 24 timer eller lenger. Metode A gir resultater for MIC og MBC, mens metode B bestemme…

Discussion

Vi har presentert fire in vitro-metoder (A-D) for å karakterisere de antibakterielle aktivitetene til nanopartikler og nanostrukturerte overflater. Mens hver av disse metodene kvantifiserer bakterievekst og levedyktighet over tid som respons på nanomaterialer, eksisterer det en viss variasjon i metodene som brukes til å måle den opprinnelige bakterielle såtettheten, veksten og levedyktigheten over tid. Tre av disse metodene, den direkte samkulturmetoden (A)¹⁷, den direkte dyrkningsme…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2