التصور والقياس الكمي لتفاعلات البروتين داخل العضيات الداخلية في مواقع الاتصال ER-Mitochondria عن طريق مقايسات ربط القرب
Summary
نمت الحاجة إلى مناهج جديدة لدراسة مواقع الاتصال الغشائية (MCSs) بسبب الاهتمام المتزايد بدراسة هذه الهياكل الخلوية ومكوناتها. هنا ، نقدم بروتوكولا يدمج تقنيات الفحص المجهري المتاحة سابقا لتحديد وقياس مجمعات البروتين داخل العضيات وبين العضيات الموجودة في MCSs.
Abstract
مواقع ملامسة الأغشية (MCSs) هي مناطق قريبة من الغشاء تسمح وتنظم التبادل الديناميكي للجزيئات الحيوية المتنوعة (أي الكالسيوم والدهون) بين العضيات المتجاورة دون إشراك اندماج الغشاء. MCSs ضرورية للتوازن الخلوي ، ويتم ضمان وظائفها من خلال المكونات المقيمة ، والتي غالبا ما توجد كمجمعات بروتينية متعددة. غالبا ما تتضمن MCSs الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وهي موقع رئيسي لتخليق الدهون وتخزين الكالسيوم الخلوي ، وهي مهمة بشكل خاص للعضيات ، مثل الميتوكوندريا ، والتي يتم استبعادها من مسارات النقل الحويصلي الكلاسيكية. في السنوات الأخيرة ، تمت دراسة MCSs بين ER والميتوكوندريا على نطاق واسع ، حيث تؤثر وظائفها بشدة على التمثيل الغذائي الخلوي / الطاقة الحيوية. بدأ تحديد العديد من البروتينات في مواقع الاتصال هذه ، بما في ذلك الحبال الغشائية وقنوات الكالسيوم وبروتينات نقل الدهون ، مما يزيد من الحاجة إلى منهجيات جديدة ونهج تقنية لدراسة مكونات MCS هذه. هنا ، نصف بروتوكولا يتكون من مناهج تقنية مشتركة ، والتي تشمل مقايسة ربط القرب (PLA) ، وتلطيخ الميتوكوندريا ، وتجزئة التصوير 3D ، والتي تسمح بالكشف عن البروتينات القريبة جسديا (>40 نانومتر) من بعضها البعض والتي توجد على نفس الغشاء في ER-mitochondria MCSs. على سبيل المثال ، استخدمنا اثنين من بروتينات نقل الدهون المثبتة على ER ، ORP5 و ORP8 ، والتي ثبت سابقا أنها تتفاعل وتتمركز في ER-mitochondria و ER-plasma membrane MCSs. من خلال ربط ORP5-ORP8 PLA بتحليل برنامج التصوير الخلوي ، كان من الممكن تقدير مسافة مركب ORP5-ORP8 من سطح الميتوكوندريا وتحديد أن حوالي 50٪ من تفاعل ORP5-ORP8 PLA يحدث في المجالات الفرعية ER على مقربة من الميتوكوندريا.
Introduction
التواصل بين العضيات هو سمة مميزة للخلايا حقيقية النواة. تتمثل إحدى الطرق التي تتواصل بها العضيات في تكوين مواقع ملامسة الغشاء (MCSs) ، وهي عبارة عن تعارضات غشائية قريبة بين عضيتين يتم الحفاظ عليهما بواسطة البروتينات الهيكلية والوظيفية ، مثل الحبال وبروتينات نقل الدهون وقنوات الكالسيوم1. يمكن إنشاء MCSs بين عضيات متشابهة أو مختلفة، وهي تتوسط في تبادل المكونات الخلوية، وهو أمر مهم للحفاظ على الاتزان الداخلي الخلوي. حتى الآن ، تم تحديد العديد من MCSs ، بما في ذلك الشبكة الإندوبلازمية (ER) – الميتوكوندريا ، غشاء ER-plasma (PM) ، وملامسات قطرات الدهون ER (LD)1. من بينها ، تلك التي تشكلت بين ER والميتوكوندريا (MERCSs) هي من بين الأكثر دراسة لأنها تشارك في تنظيم العديد من الوظائف الخلوية ، بما في ذلك توازن الدهون والكالسيوم2. نظرا لأن الميتوكوندريا مستبعدة إلى حد كبير من مسارات النقل الحويصلية الكلاسيكية ، فإنها تعتمد على MERCS وعلى مكوناتها الجزيئية لاستيراد الدهون الرئيسية أو سلائف الدهون من ER. يضمن النقل غير الحويصلي لهذه الدهون عبر MERCSs الحفاظ على التركيب السليم لدهون الميتوكوندريا ، فضلا عن سلامتها الوظيفية والهيكلية3.
نظرا للمشاركة الحاسمة ل MCSs في الوظائف الخلوية المختلفة ، فقد زاد الاهتمام بتوفير فهم أعمق لمكوناتها الجزيئية بشكل كبير في السنوات الأخيرة. تم استخدام عدة أنواع من الأساليب القائمة على التصوير لتعزيز المعرفة حول MCSs. من بينها ، تم استخدام مقايسة ربط القرب القائمة على مسبار التألق (PLA) على نطاق واسع كمؤشر على وفرة MCSs من خلال الكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين بين العضيات (في نطاق الكشف عن 40 نانومتر) عند المستويات الداخلية4. على سبيل المثال ، تم تصور MERCSs وقياسها باستخدام PLA بين العديد من أزواج بروتينات الميتوكوندريا-ER ، بما في ذلك VDAC1-IP3R و GRP75-IP3R و CypD-IP3 و PTPIP51-VAPB5،6،7،8. على الرغم من استخدام هذه التقنية للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين بين العضيات الموجودة في MCS5،7،9،10،11 وتحديدها ، إلا أن معظم الدراسات لم تجمع بين PLA وتلطيخ العضيات. وبالتالي ، لم يتم تطوير طريقة كمية تسمح بقياس القرب بين تفاعلات PLA والعضيات المرتبطة بها. وهكذا ، حتى الآن ، في حالة بروتينات ER ، لم يتم تمييز تفاعلها داخل المجالات الفرعية الغشائية على اتصال مع العضيات الأخرى عن تفاعلها داخل شبكة ER الموزعة على نطاق واسع.
هنا ، نصف بروتوكولا للكشف عن تفاعلات PLA بين البروتينات الموجودة في غشاء نفس العضية وتحليل قربها من غشاء العضية الشريكة في MCS. تم تطوير هذا البروتوكول بناء على فرضيتين: 1) الدراسات السابقة التي تظهر أنه في ظروف التعبير المفرط ، فإن بروتينات نقل الدهون ER ORP5 و ORP8 تتمركز وتتفاعل في ER-mitochondria و ER-PM MCSs12،13،14،15 وأن ORP5 يتمركز في جهات اتصال ER-LD16،17 ؛ 2) التقنيات الحالية ، بما في ذلك جيش التحرير الشعبى الصينى ، المجهر متحد البؤر ، وضع العلامات العضية ، وتحليل التصوير 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد وقياس تفاعلات PLA بين البروتين بين العضيات في MCSs ، ولا سيما في MERCSs. حداثة البروتوكول هو أنه يجمع بين PLA مع وضع العلامات على عضيات متعددة ، والمجهر متحد البؤر ، وتحليل صور 3D لتوطين وقياس تفاعلات PLA بين بروتينين مقيمين في نفس الغشاء ، في هذه الحالة داخل غشاء ER على م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD) ، وبرنامج ATIP-Avenir ، ومؤسسة البحوث الطبية (رقم 206548) ، ومؤسسة Vaincre Alzheimer (eOTP: 669122 LS 212527) ، الوكالة الوطنية للبحوث (ANR-11-EQPX-0029 / Morphoscope ، ANR-10-INBS-04 / FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02 / Saclay Plant Sciences).
Materials
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
References
- Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287 (2019).
- Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
- Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
- Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).
- Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
- Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).
- Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).
- Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
- Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
- Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
- Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
- Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757 (2017).
- Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).
- Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).
- Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
