Visualisation et quantification des interactions endogènes intra-organites protéiques au niveau des sites de contact ER-mitochondries par des tests de ligature de proximité
Summary
Le besoin de nouvelles approches pour étudier les sites de contact membranaire (MCS) s’est accru en raison de l’intérêt croissant pour l’étude de ces structures cellulaires et de leurs composants. Nous présentons ici un protocole qui intègre les technologies de microscopie précédemment disponibles pour identifier et quantifier les complexes protéiques intra-organites et inter-organites qui résident dans les MCS.
Abstract
Les sites de contact membranaire (MCS) sont des zones de proximité membranaire qui permettent et régulent l’échange dynamique de diverses biomolécules (c’est-à-dire le calcium et les lipides) entre les organites juxtaposés sans impliquer la fusion membranaire. Les MCS sont essentiels à l’homéostasie cellulaire, et leurs fonctions sont assurées par les composants résidents, qui existent souvent sous forme de complexes protéiques multimériques. Les MCS impliquent souvent le réticulum endoplasmique (RE), un site majeur de synthèse des lipides et de stockage cellulaire du calcium, et sont particulièrement importants pour les organites, tels que les mitochondries, qui sont exclus des voies de transport vésiculaires classiques. Au cours des dernières années, les MCS entre le RE et les mitochondries ont été largement étudiés, car leurs fonctions ont un impact important sur le métabolisme cellulaire/bioénergétique. Plusieurs protéines ont commencé à être identifiées sur ces sites de contact, notamment les attaches membranaires, les canaux calciques et les protéines de transfert de lipides, ce qui soulève le besoin de nouvelles méthodologies et approches techniques pour étudier ces composants MCS. Nous décrivons ici un protocole composé d’approches techniques combinées, qui incluent le test de ligature de proximité (PLA), la coloration des mitochondries et la segmentation par imagerie 3D, qui permet la détection de protéines physiquement proches (>40 nm) les unes des autres et qui résident sur la même membrane au niveau des MCS des mitochondries ER. Par exemple, nous avons utilisé deux protéines de transfert de lipides ancrées dans le RE, ORP5 et ORP8, dont il a déjà été démontré qu’elles interagissent et se localisent au niveau des mitochondries du RE et des MCS de la membrane plasmique du RE. En associant le PLA ORP5-ORP8 à l’analyse d’un logiciel d’imagerie cellulaire, il a été possible d’estimer la distance du complexe ORP5-ORP8 par rapport à la surface mitochondriale et de déterminer qu’environ 50% de l’interaction ORP5-ORP8 PLA se produit au niveau des sous-domaines ER à proximité des mitochondries.
Introduction
La communication inter-organites est une caractéristique déterminante des cellules eucaryotes. L’une des façons dont les organites communiquent est de former des sites de contact membranaire (MCS), qui sont des oppositions membranaires étroites entre deux organites qui sont maintenues par des protéines structurelles et fonctionnelles, telles que les attaches, les protéines de transfert de lipides et les canaux calciques1. Les MCS peuvent être établis entre des organites similaires ou différents, et ils interviennent dans l’échange de composants cellulaires, ce qui est important pour maintenir l’homéostasie cellulaire. À ce jour, plusieurs MCS ont été identifiés, notamment les mitochondries du réticulum endoplasmique (RE), les contacts ER-membrane plasmique (PM) et les contacts ER-gouttelettes lipidiques (LD)1. Parmi eux, ceux formés entre le RE et les mitochondries (MERCSs) sont parmi les plus étudiés car ils sont impliqués dans la régulation de plusieurs fonctions cellulaires, dont l’homéostasie lipidique et calcique2. Comme les mitochondries sont largement exclues des voies de transport vésiculaires classiques, elles dépendent des MERCS et de leurs constituants moléculaires pour importer des lipides clés ou des précurseurs lipidiques du RE. Le transport non vésiculaire de ces lipides à travers les MERCS assure le maintien d’une bonne composition lipidique mitochondriale, ainsi que leur intégrité fonctionnelle et structurelle3.
Compte tenu de l’implication cruciale des MCS dans diverses fonctions cellulaires, l’intérêt pour une compréhension plus approfondie de leurs composants moléculaires a considérablement augmenté au cours des dernières années. Plusieurs types d’approches basées sur l’imagerie ont été utilisés pour faire progresser les connaissances sur les MCS. Parmi eux, le test de ligature de proximité (PLA) basé sur une sonde de fluorescence a été largement utilisé comme indicateur de l’abondance des MCS en détectant les interactions protéine-protéine inter-organites (dans une plage de détection de 40 nm) à des niveaux endogènes4. Par exemple, les MERCS ont été visualisés et quantifiés en utilisant le PLA entre plusieurs paires de protéines mitochondries-RE, notamment VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 et PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Bien que cette technologie ait été utilisée pour détecter et quantifier les interactions protéine-protéine inter-organites présentes au MCS 5,7,9,10,11, la plupart des études n’ont pas combiné le PLA avec la coloration des organites. Par conséquent, une méthode quantitative permettant de mesurer la proximité entre les interactions PLA et les organites associés n’a pas encore été développée. Ainsi, jusqu’à présent, dans le cas des protéines RE, leur interaction au sein des sous-domaines membranaires en contact avec d’autres organites n’a pas été distinguée de leur interaction au sein du réseau RE largement distribué.
Nous décrivons ici un protocole permettant de détecter les interactions PLA entre les protéines qui résident dans la membrane d’un même organite et d’analyser leur proximité avec la membrane de l’organite partenaire au niveau du MCS. Ce protocole a été développé sur la base de deux prémisses : 1) des études antérieures montrant que, dans des conditions de surexpression, les protéines de transfert de lipides ER ORP5 et ORP8 co-localisent et interagissent au niveau des mitochondries ER-et des MCS ER-PM 12,13,14,15 et que ORP5 se localise aux contacts ER-LD 16,17 ; 2) les technologies existantes, y compris le PLA, la microscopie confocale, le marquage des organites et l’analyse par imagerie 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole a été conçu pour identifier et quantifier les interactions inter-organites entre les protéines PLA au niveau des MCS, en particulier au niveau des MERCS. La nouveauté du protocole est qu’il combine le PLA avec le marquage d’organites multiples, la microscopie confocale et l’analyse d’images 3D pour localiser et quantifier les interactions PLA entre deux protéines résidant dans la même membrane, dans ce cas au sein de la membrane du RE à proximité immédiate de la membrane des mitochondries …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par l’ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), le Programme ATIP-Avenir, la Fondation pour la Recherche Médicale (n°206548), et la Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP :669122 LS 212527), l’I’Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging ; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Sciences du Végétal).
Materials
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
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