Visualisering och kvantifiering av endogena intraorganella proteininteraktioner vid ER-mitokondrierkontaktställen genom närhetsligeringsanalyser
Summary
Behovet av nya metoder för att studera membrankontaktställen (MCS) har ökat på grund av ett ökande intresse för att studera dessa cellulära strukturer och deras komponenter. Här presenterar vi ett protokoll som integrerar tidigare tillgängliga mikroskopitekniker för att identifiera och kvantifiera intraorganella och interorganella proteinkomplex som finns vid MCS.
Abstract
Membrankontaktställen (MCS) är områden med nära membrannärhet som tillåter och reglerar det dynamiska utbytet av olika biomolekyler (dvs. kalcium och lipider) mellan de parallella organellerna utan att involvera membranfusion. MCS är viktiga för cellulär homeostas, och deras funktioner säkerställs av de inneboende komponenterna, som ofta existerar som multimera proteinkomplex. MCS involverar ofta det endoplasmatiska nätverket (ER), en viktig plats för lipidsyntes och cellulär kalciumlagring, och är särskilt viktiga för organeller, såsom mitokondrierna, som är uteslutna från de klassiska vesikulära transportvägarna. Under de senaste åren har MCS mellan ER och mitokondrier studerats i stor utsträckning, eftersom deras funktioner starkt påverkar cellulär metabolism/bioenergetik. Flera proteiner har börjat identifieras på dessa kontaktställen, inklusive membranbindningar, kalciumkanaler och lipidöverföringsproteiner, vilket ökar behovet av nya metoder och tekniska tillvägagångssätt för att studera dessa MCS-komponenter. Här beskriver vi ett protokoll som består av kombinerade tekniska tillvägagångssätt, som inkluderar proximitetsligeringsanalys (PLA), mitokondriefärgning och 3D-avbildningssegmentering, som möjliggör detektion av proteiner som är fysiskt nära (>40 nm) varandra och som finns på samma membran vid ER-mitokondrier MCS. Till exempel använde vi två ER-förankrade lipidöverföringsproteiner, ORP5 och ORP8, som tidigare har visat sig interagera och lokalisera vid ER-mitokondrier och ER-plasmamembran MCS. Genom att associera ORP5-ORP8 PLA med analys av cellavbildningsprogramvara var det möjligt att uppskatta avståndet mellan ORP5-ORP8-komplexet och fastställa att cirka 50 % av ORP5-ORP8 PLA-interaktionen sker vid ER-underdomäner i närheten av mitokondrier.
Introduction
Interorganellkommunikation är en definierande egenskap hos eukaryota celler. Ett sätt på vilket organeller kommunicerar är genom att bilda membrankontaktställen (MCS), som är nära membranoppositioner mellan två organeller som upprätthålls av strukturella och funktionella proteiner, såsom tjuder, lipidöverföringsproteiner och kalciumkanaler1. MCS kan etableras mellan liknande eller olika organeller, och de förmedlar utbytet av cellulära komponenter, vilket är viktigt för att upprätthålla cellulär homeostas. Hittills har flera MCS identifierats, inklusive endoplasmatiskt retikulum (ER)-mitokondrier, ER-plasmamembran (PM) och ER-lipiddroppar (LD) kontakter1. Bland dem är de som bildas mellan ER och mitokondrierna (MERCS) bland de mest studerade eftersom de är involverade i regleringen av flera cellulära funktioner, inklusive lipid- och kalciumhomeostas2. Eftersom mitokondrier till stor del är uteslutna från de klassiska vesikulära transportvägarna förlitar de sig på MERCS och deras molekylära beståndsdelar för att importera viktiga lipider eller lipidprekursorer från ER. Den icke-vesikulära transporten av dessa lipider över MERCs säkerställer upprätthållandet av korrekt mitokondriell lipidsammansättning, såväl som deras funktionella och strukturella integritet3.
Med tanke på den avgörande involveringen av MCS i olika cellulära funktioner har intresset för att ge en djupare förståelse för deras molekylära komponenter ökat kraftigt under de senaste åren. Flera typer av bildbaserade metoder har använts för att öka kunskapen om MCS. Bland dem har fluorescensprobbaserad proximitetsligeringsanalys (PLA) använts i stor utsträckning som en indikator på förekomsten av MCS genom att detektera interorganellprotein-proteininteraktioner (i ett detektionsområde på 40 nm) vid endogena nivåer4. Till exempel har MERCs visualiserats och kvantifierats genom att använda PLA mellan flera mitokondrier-ER-proteinpar, inklusive VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 och PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Även om denna teknik har använts för att detektera och kvantifiera interaktioner mellan organeller och proteiner som finns vid MCS 5,7,9,10,11, kombinerade de flesta studierna inte PLA med organellfärgning. Följaktligen har en kvantitativ metod som gör det möjligt att mäta närheten mellan PLA-interaktioner och associerade organeller ännu inte utvecklats. Således, när det gäller ER-proteiner, har deras interaktion inom membransubdomäner i kontakt med andra organeller hittills inte särskiljts från deras interaktion inom det utbredda ER-nätverket.
Här beskriver vi ett protokoll för att detektera PLA-interaktioner mellan proteiner som finns i membranet i samma organell och för att analysera deras närhet till membranet i partnerorganellen vid MCS. Detta protokoll utvecklades baserat på två premisser: 1) tidigare studier som visar att, under överuttrycksförhållanden, ER-lipidöverföringsproteinerna ORP5 och ORP8 samlokaliseras och interagerar vid ER-mitokondrier och ER-PM MCS 12,13,14,15 och att ORP5 lokaliseras vid ER-LD-kontakter 16,17; 2) befintlig teknik, inklusive PLA, konfokalmikroskopi, organellmärkning och 3D-bildanalys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll utformades för att identifiera och kvantifiera PLA-interaktioner mellan organellproteiner vid MCS, särskilt vid MERCS. Det nya med protokollet är att det kombinerar PLA med märkning av flera organeller, konfokalmikroskopi och 3D-bildanalys för att lokalisera och kvantifiera PLA-interaktioner mellan två proteiner som finns i samma membran, i detta fall inom ER-membranet i närheten av mitokondriemembranet (MAM) eller med MAM och LD samtidigt. Detta protokoll kan användas som ett verktyg för att val…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir-programmet, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) och Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I’Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences).
Materials
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
References
- Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287 (2019).
- Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
- Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
- Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).
- Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
- Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).
- Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).
- Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
- Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
- Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
- Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
- Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757 (2017).
- Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).
- Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).
- Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
