쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화
Summary
후근 신경절과 슈반 세포의 공동 배양 시스템에서 말초 신경계의 수초화를 연구 할 수 있습니다. 이 모델은 말초 수초화를 관찰 및 정량화하고 미엘린 외피에 대한 관심 화합물의 효과를 연구할 수 있는 실험적 기회를 제공합니다.
Abstract
수초화 과정은 신경계에서 빠르고 충분한 신호 전달을 가능하게 하는 데 필수적입니다. 말초 신경계에서 뉴런과 슈반 세포는 축삭의 수초화를 제어하기 위해 복잡한 상호 작용에 관여합니다. 이러한 상호 작용의 교란과 수초의 파괴는 염증성 신경병증의 특징이며 신경퇴행성 장애에서 이차적으로 발생합니다. 여기에서 우리는 말초 신경계의 수초화 과정을 조사하고, 축삭-슈반 세포 상호 작용을 연구하고, 각 세포 유형에 대한 치료제의 잠재적 효과를 개별적으로 평가하기 위해 말초 축삭의 강력한 수초화를 개발하는 후근 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양 모델을 제시합니다. 방법론적으로, 배아 쥐(E13.5)의 등쪽 뿌리 신경절을 수확하고, 주변 조직으로부터 해리시키고, 3일 동안 전체 외식편으로 배양하였다. 슈반 세포는 3 주령의 성인 쥐로부터 분리되었고, 좌골 신경은 효소에 의해 소화되었다. 생성된 슈반 세포는 자기 활성화 세포 분류에 의해 정제되고 뉴레귤린 및 포스콜린이 풍부한 조건 하에서 배양되었습니다. 후근 신경절 외식편 배양 3일 후, 30,000개의 슈반 세포를 아스코르브산을 함유하는 배지에서 하나의 후근 신경절 외식편에 첨가했습니다. 수초화의 첫 징후는 면역세포화학적 염색에서 미엘린 염기성 단백질에 대한 산란 신호를 통해 공동 배양 10일째에 검출되었습니다. 14일째부터 수초가 형성되어 축삭을 따라 전파되었습니다. 수초화는 축삭 밀도의 차이를 설명하기 위해 수초화 면적과 축삭 면적의 비율로 미엘린 염기성 단백질 염색으로 정량화할 수 있습니다. 이 모델은 시험관 내에서 말초 수초화의 다양한 측면을 연구할 수 있는 실험 기회를 제공하며, 이는 말초 신경계의 염증 및 신경퇴행성 질환에서 탈수초화 및 신경변성의 병리와 가능한 치료 기회를 이해하는 데 중요합니다.
Introduction
말초 신경계(PNS)에서 빠른 정보 전달은 미엘린으로 둘러싸인 축삭에 의해 매개됩니다. 축삭의 수초화는 전기 자극의 빠른 전파를 가능하게 하는 데 필수적인데, 이는 신경 섬유의 전도 속도가 축삭 직경 및 미엘린 두께와 상관관계가 있기 때문입니다1. 말초에서 중추신경계(CNS)로의 감각 신호 전달은 후근 신경절(DRG)이라고 하는 후근의 확대에 존재하는 1차 감각 뉴런의 활성화에 의존합니다. 미엘린의 형성과 유지를 위해, PNS의 수초화 신경교세포인 축삭과 슈반 세포 사이의 지속적인 소통은 필수적이다2.
PNS의 많은 질병은 일차 축삭 또는 탈수초 손상에 의한 정보 전달을 방해하여 감각 이상 또는 감각 이상을 유발합니다. 1차 감각 뉴런은 뉴런 손상 후 뉴런과 주변 슈반 세포 사이의 복잡한 상호작용에 의해 어느 정도 재생될 수 있는 능력을 가지고 있다3. 이 경우, 슈반 세포는 세포 재프로그래밍을 통해 축삭 및 미엘린 파편을 제거하고 축삭 재생을 촉진하여 재수초화를 일으킬 수 있다4. PNS의 탈수초성 장애에 대한 가능한 치료 옵션을 찾기 위해서는 건강과 질병에서 수초화의 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 미엘린은 또한 급성 신경외상에 의해 손상될 수 있으며, 말초 신경 손상 후 기능 회복을 촉진하기 위해 수초화를 촉진하는 접근법이 연구 중이다5.
말초 수초화에 대한 우리의 지식은 Schwann 세포와 감각 뉴런의 수초 공배양으로부터 크게 도움이 되었습니다. 첫 번째 접근법이 적용된 이래로 6,7,8, 수초화는 다른 공동 배양 시스템 9,10,11을 사용하여 집중적으로 연구되었습니다. 여기에서 우리는 후근 신경절 축삭의 강력한 시험관 내 수초화를 위한 빠르고 쉬운 프로토콜을 제공합니다. Schwann 세포 준비를 위한 프로토콜은 이전에 Pitarokoili et al.13에 발표된 Andersen et al.12의 프로토콜을 기반으로 합니다. 우리는 어린 쥐에서 유래한 Schwann 세포와 배아 DRG 외식편 배양을 사용하여 공동 배양을 수행하며, 이 배양에서 수초화가 약 14일에 발생합니다. 이 방법의 목표는 직접적인 축삭-슈반 세포 상호작용의 결과로서 미엘린의 형성을 조사하는 시스템을 제공하고, PNS 수초화의 조절제를 연구하는 것이다. 해리된 신경 세포 배양과 비교하여 DRG 외식편은 해부학적으로 더 보존되고 긴 축삭 돌기를 형성합니다. 수초화된 축삭 영역의 정량화는 공배양에서 수초화에 대한 충분한 판독값을 제공합니다. 상기 방법은 PNS 수초화에 대한 그의 잠재적 효과에 대해 치료 화합물을 스크리닝하는 데 유용한 도구이며, 또한 동물 모델에서 생체내 연구 이외에 활용될 수 있다14.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 두 개의 개별 세포 유형 배양인 Schwann 세포와 후근 신경절 외식편을 병합하여 시험관 내 수초화 생성을 위한 빠르고 쉬운 프로토콜을 제시합니다.
프로토콜의 중요한 단계는 특히 배양 첫날에 DRG 외식편을 재배하는 것입니다. DRG는 강력한 축삭 네트워크가 구축되기 전에 매우 약하기 쉬우며, 예를 들어 인큐베이터에서 꺼내거나 배지를 교체하는 동안 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
조언과 지원을 해주신 Ralf Gold 교수님과 Gisa Ellrichmann 박사님께 감사드립니다.
Materials
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
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