Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

Summary

No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.

Abstract

O processo de mielinização é essencial para permitir a transdução rápida e suficiente do sinal no sistema nervoso. No sistema nervoso periférico, neurônios e células de Schwann se envolvem em uma interação complexa para controlar a mielinização dos axônios. Distúrbios dessa interação e quebra da bainha de mielina são características das neuropatias inflamatórias e ocorrem secundariamente em doenças neurodegenerativas. Aqui, apresentamos um modelo de cocultura de explantes do gânglio da raiz dorsal e células de Schwann, que desenvolve uma mielinização robusta de axônios periféricos para investigar o processo de mielinização no sistema nervoso periférico, estudar as interações axônio-célula de Schwann e avaliar os potenciais efeitos dos agentes terapêuticos sobre cada tipo celular separadamente. Metodologicamente, gânglios da raiz dorsal de ratos embrionários (E13.5) foram colhidos, dissociados de seu tecido circundante e cultivados como explantes inteiros por 3 dias. Células de Schwann foram isoladas de ratos adultos com 3 semanas de idade, e os nervos ciáticos foram digeridos enzimaticamente. As células de Schwann resultantes foram purificadas por triagem celular ativada por magnetismo e cultivadas sob condições enriquecidas com neuregulina e forskolina. Após 3 dias de cultura do explante do gânglio da raiz dorsal, 30.000 células de Schwann foram adicionadas a um explante do gânglio da raiz dorsal em meio contendo ácido ascórbico. Os primeiros sinais de mielinização foram detectados no 10º dia de cocultivo, através de sinais esparsos para proteína básica de mielina na coloração imunocitoquímica. A partir do 14º dia, bainhas de mielina foram formadas e propagadas ao longo dos axônios. A mielinização pode ser quantificada pela coloração da proteína básica da mielina como uma razão entre a área de mielinização e a área axonal, para explicar as diferenças na densidade axonal. Este modelo oferece oportunidades experimentais para o estudo de vários aspectos da mielinização periférica in vitro, o que é crucial para a compreensão da patologia e possíveis oportunidades de tratamento para desmielinização e neurodegeneração em doenças inflamatórias e neurodegenerativas do sistema nervoso periférico.

Introduction

No sistema nervoso periférico (SNP), a rápida transdução de informação é mediada por axônios envoltos em mielina. A mielinização dos axônios é essencial para permitir a rápida propagação dos impulsos elétricos, uma vez que a velocidade de condução das fibras nervosas correlaciona-se com o diâmetro do axônio e a espessura da mielina¹. A sinalização sensorial da periferia para o sistema nervoso central (SNC) depende da ativação de neurônios sensoriais de primeira ordem que residem em ampliações da raiz dorsal, denominados gânglios da raiz dorsal (DRG). Para a formação e manutenção da mielina,^{é obrigatória a} comunicação contínua entre os axônios e as células de Schwann, que são as células mielinizantes da Glia no SNP2.

Muitas doenças dos SPN perturbam a transdução de informações por dano axonal primário ou desmielinizante, resultando em hipoestesia ou disestesia. Os neurônios sensoriais de primeira ordem têm a capacidade de se regenerar até certo ponto após dano neuronal, por meio de uma complexa interação entre o neurônio e as células de Schwann^{circundantes 3}. Nesse caso, as células de Schwann podem sofrer reprogramação celular para limpar debris axonais e mielínicos e promover regeneração axonal, resultando em remielinização⁴. A compreensão dos mecanismos da mielinização na saúde e na doença é importante, a fim de encontrar possíveis opções de tratamento para as desordens desmielinizantes dos SPN. A mielina também pode ser lesada por neurotrauma agudo, e abordagens para promover mielinização para avançar na recuperação funcional após lesão de nervo periférico estão sendo investigadas⁵.

Nosso conhecimento da mielinização periférica tem se beneficiado em grande parte das coculturas mielinizantes de células de Schwann e neurônios sensoriais. Desde as primeiras^{abordagens 6,7,8}, a mielinização tem sido intensamente estudada com o uso de diferentes sistemas de cocultura9,10,11. Aqui, fornecemos um protocolo rápido e fácil para mielinização in vitro robusta de axônios ganglionares da raiz dorsal. O protocolo para preparação de células de Schwann é baseado no protocolo de Andersen et al.12, publicado anteriormente em Pitarokoili et ^al.13. Utilizamos células de Schwann derivadas de ratos juvenis e culturas embrionárias de explantes DRG para a cocultura, na qual a mielinização ocorre por volta do 14º dia. O objetivo do método é fornecer um sistema para investigar a formação de mielina como resultado da interação direta axônio-célula de Schwann, e estudar moduladores da mielinização do SNP. Em comparação com culturas de células neuronais dissociadas, os explantes DRG são mais anatomicamente preservados e formam processos axonais longos. A quantificação da área do axônio mielinizado fornece uma leitura suficiente para mielinização na cocultura. O método é uma ferramenta valiosa para triagem de compostos terapêuticos quanto ao seu potencial efeito sobre a mielinização dos SPN, podendo também ser utilizado em complemento a estudos in vivo em modelos^animais14.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias para o cuidado e uso de animais de laboratório. 1. Cultura de células de Schwann Revestimento para cultura de células de SchwannRevestir as placas de cultura celular em condições estéreis. Aplicar 2 mL de poli-L-lisina (PLL) a 0,01% em duas placas de cultura de tecidos (CT) de 60 mm cada e incubar durante a noite a 4 °C. Retire o PLL, lave …

Representative Results

A mielinização na cocultura foi avaliada nos dias 10, 12, 14, 16, 18 e 20. Os explantes DRG e as células de Schwann foram corados para MBP, βIII-tubulina e DAPI. A rede axonal na cocultura foi densa e não se alterou visivelmente no decorrer do tempo de observação. Os primeiros sinais de mielina, na forma de pequenos fragmentos, foram detectáveis no 10º dia e aumentaram no 12º dia (Figura 2). As áreas positivas para PAM aumentaram ao longo do tempo até o 20º dia de cultura. A mie…

Discussion

Aqui, apresentamos um protocolo rápido e fácil para a geração de mielinização in vitro através da fusão de duas culturas de tipos celulares distintas, células de Schwann e explantes do gânglio da raiz dorsal.

Uma etapa crítica do protocolo é o cultivo de explantes DRG, especialmente nos primeiros dias de cultivo. Os DRG são muito frágeis antes que uma rede axonal forte seja construída e devem ser manuseados com muito cuidado, por exemplo, quando retirados da incubadora …

Materials

Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285