Миелинизация периферических аксонов in vitro в кокультуре ганглиозных эксплантатов дорсальных корешков крыс и шванновских клеток

Summary

В системе кокультуры ганглиев дорсальных корешков и шванновских клеток можно изучать миелинизацию периферической нервной системы. Эта модель предоставляет экспериментальные возможности для наблюдения и количественной оценки периферической миелинизации и изучения влияния интересующих соединений на миелиновую оболочку.

Abstract

Процесс миелинизации необходим для обеспечения быстрой и достаточной передачи сигнала в нервной системе. В периферической нервной системе нейроны и шванновские клетки участвуют в сложном взаимодействии, чтобы контролировать миелинизацию аксонов. Нарушения этого взаимодействия и разрушение миелиновой оболочки являются признаками воспалительных невропатий и возникают вторично при нейродегенеративных расстройствах. Здесь мы представляем модель кокультуры ганглиозных эксплантатов дорсальных корешков и шванновских клеток, которая развивает надежную миелинизацию периферических аксонов для исследования процесса миелинизации в периферической нервной системе, изучения взаимодействия аксон-шванновских клеток и оценки потенциального воздействия терапевтических агентов на каждый тип клеток в отдельности. Методологически ганглии дорсальных корешков эмбриональных крыс (E13.5) собирали, диссоциировали от окружающих их тканей и культивировали как целые эксплантаты в течение 3 дней. Шванновские клетки были выделены от 3-недельных взрослых крыс, а седалищные нервы были ферментативно переварены. Полученные шванновские клетки очищали магнитно-активированной сортировкой клеток и культивировали в условиях, обогащенных нейрегулином и форсколином. После 3 дней культивирования ганглиозной эксплантата дорсального корешка 30 000 шванновских клеток добавляли к одному ганглиозному эксплантату дорсального корня в среде, содержащей аскорбиновую кислоту. Первые признаки миелинизации были обнаружены на 10-й день кокультуры через рассеянные сигналы к основному белку миелина при иммуноцитохимическом окрашивании. Начиная с 14-го дня, миелиновые оболочки формировались и размножались вдоль аксонов. Миелинизация может быть количественно определена окрашиванием основного белка миелина как отношение площади миелинизации и площади аксонов, чтобы учесть различия в плотности аксонов. Данная модель предоставляет экспериментальные возможности для изучения различных аспектов периферической миелинизации in vitro, что имеет решающее значение для понимания патологии и возможных возможностей лечения демиелинизации и нейродегенерации при воспалительных и нейродегенеративных заболеваниях периферической нервной системы.

Introduction

В периферической нервной системе (ПНС) быстрая информационная трансдукция опосредована аксонами, обернутыми миелином. Миелинизация аксонов необходима для обеспечения быстрого распространения электрических импульсов, поскольку скорость проводимости нервных волокон коррелирует с диаметром аксона и толщиной миелина¹. Сенсорная передача сигналов от периферии к центральной нервной системе (ЦНС) основана на активации сенсорных нейронов первого порядка, которые находятся в расширениях дорсального корешка, называемых ганглиями дорсальных корешков (DRG). Для образования и поддержания миелина необходима непрерывная связь между аксонами и шванновскими клетками, которые являются миелинизирующими глиальными клетками в ПНС.².

Многие заболевания ПНС нарушают трансдукцию информации либо первичным аксональным, либо демиелинизирующим повреждением, что приводит к гипестезии или дизестезии. Сенсорные нейроны первого порядка обладают способностью к регенерации до некоторой степени после повреждения нейронов путем сложного взаимодействия между нейроном и окружающими шванновскими клетками³. В этом случае шванновские клетки могут подвергаться клеточному перепрограммированию, чтобы очистить аксональный и миелиновый мусор и способствовать регенерации аксонов, что приводит к ремиелинизации⁴. Понимание механизмов миелинизации в здоровье и заболевании важно для того, чтобы найти возможные варианты лечения демиелинизирующих расстройств ПНС. Миелин также может быть поврежден острой нейротравмой, и в настоящее время исследуются подходы, способствующие миелинизации для ускорения функционального восстановления после повреждения периферических нервов⁵.

Наши знания о периферической миелинизации в значительной степени выиграли от миелинизирующих кокультур шванновских клеток и сенсорных нейронов. С тех пор, как были применены первые подходы ^6,7,8, миелинизация интенсивно изучалась с использованием различных систем кокультур^9,10,11. Здесь мы предлагаем быстрый и простой протокол для надежной миелинизации in vitro аксонов ганглиев дорсальных корешков. Протокол подготовки шванновских клеток основан на протоколе Andersen et al.12, ранее опубликованном в Pitarokoili et ^al.13. Мы используем шванновские клетки, полученные от молодых крыс, и эмбриональные культуры эксплантатов DRG для совместной культуры, в которой миелинизация происходит примерно на 14-й день. Целью метода является создание системы для исследования образования миелина в результате прямого взаимодействия аксон-шванновских клеток, а также изучение модуляторов миелинизации ПНС. По сравнению с диссоциированными культурами нейрональных клеток, эксплантаты DRG более анатомически сохранены и образуют длинные аксональные отростки. Количественная оценка площади миелинизированного аксона обеспечивает достаточное считывание миелинизации в кокультуре. Этот метод является ценным инструментом для скрининга терапевтических соединений на предмет их потенциального влияния на миелинизацию ПНС, а также может быть использован в дополнение к исследованиям in vivo на животных моделях¹⁴.

Protocol

Все процедуры были выполнены в соответствии с Директивой Совета Европейских сообществ по уходу и использованию лабораторных животных. 1. Шванновская клеточная культура Покрытие для шванновской клеточной культурыПокройте чашки для клеточных культур …

Representative Results

Миелинизацию в кокультуре оценивали на 10, 12, 14, 16, 18 и 20 сутки. Эксплантаты DRG и шванновские клетки окрашивали на MBP, βIII-тубулин и DAPI. Аксональная сеть в кокультуре была плотной и не изменялась заметно во время наблюдения. Первые признаки миелина в виде мелких фрагментов были обнаружены на 1…

Discussion

Здесь мы представляем быстрый и простой протокол генерации миелинизации in vitro путем слияния двух отдельных культур клеточного типа, шванновских клеток и эксплантатов ганглиев дорсальных корешков.

Важнейшим этапом протокола является выращивание эксплантатов ДРГ, ?…

Materials

Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285