I samodlingssystemet av dorsala rotganglier och Schwann-celler kan myelinering av det perifera nervsystemet studeras. Denna modell ger experimentella möjligheter att observera och kvantifiera perifer myelinisering och att studera effekterna av föreningar av intresse på myelinskidan.
Myeliniseringsprocessen är avgörande för att möjliggöra snabb och tillräcklig signaltransduktion i nervsystemet. I det perifera nervsystemet engagerar neuroner och Schwann-celler en komplex interaktion för att kontrollera myelineringen av axoner. Störningar av denna interaktion och nedbrytning av myelinskidan är kännetecken för inflammatoriska neuropatier och förekommer sekundärt vid neurodegenerativa störningar. Här presenterar vi en samodlingsmodell av dorsala rotganglieexplantat och Schwann-celler, som utvecklar en robust myelinering av perifera axoner för att undersöka myeliniseringsprocessen i det perifera nervsystemet, studera axon-Schwann-cellinteraktioner och utvärdera de potentiella effekterna av terapeutiska medel på varje celltyp separat. Metodologiskt skördades dorsala rotganglioner av embryonala råttor (E13.5), dissocierades från sin omgivande vävnad och odlades som hela explantat i 3 dagar. Schwannceller isolerades från 3 veckor gamla vuxna råttor och ischiasnerver smältes enzymatiskt. De resulterande Schwann-cellerna renades genom magnetaktiverad cellsortering och odlades under neuregulin- och forskolinberikade förhållanden. Efter 3 dagar av dorsal root ganglion explantkultur tillsattes 30 000 Schwann-celler till en dorsal root ganglion explantat i ett medium innehållande askorbinsyra. De första tecknen på myelinisering upptäcktes på dag 10 av samodling, genom spridda signaler för myelinbasprotein vid immunocytokemisk färgning. Från dag 14 och framåt bildades myelinmantlar och förökades längs axonerna. Myelinisering kan kvantifieras genom myelinbasisk proteinfärgning som ett förhållande mellan myeliniseringsområdet och axonområdet för att ta hänsyn till skillnaderna i axonal densitet. Denna modell ger experimentella möjligheter att studera olika aspekter av perifer myelinisering in vitro, vilket är avgörande för att förstå patologin och möjliga behandlingsmöjligheter för demyelinisering och neurodegeneration vid inflammatoriska och neurodegenerativa sjukdomar i det perifera nervsystemet.
I det perifera nervsystemet (PNS) förmedlas snabb informationstransduktion av myelinlindade axoner. Myelineringen av axoner är avgörande för att möjliggöra snabb utbredning av elektriska impulser, eftersom nervfibrernas ledningshastighet korrelerar med axondiametern och myelintjockleken1. Sensorisk signalering från periferin till centrala nervsystemet (CNS) bygger på aktivering av första ordningens sensoriska neuroner som ligger i utvidgningar av dorsalroten, kallad dorsala rotganglier (DRG). För bildning och underhåll av myelin är kontinuerlig kommunikation mellan axoner och Schwann-celler, vilka är de myeliniserande Glia-cellerna i PNS, obligatorisk2.
Många sjukdomar i PNS stör överföringen av information genom antingen primär axonal eller demyeliniserande skada, vilket resulterar i hypestesi eller dysestesi. Första ordningens sensoriska neuroner har förmågan att regenerera i viss utsträckning efter neuronal skada, genom en komplex interaktion mellan neuronen och omgivande Schwann-celler3. I detta fall kan Schwann-celler genomgå cellulär omprogrammering för att rensa axonalt såväl som myelinskräp och främja axonal regenerering, vilket resulterar i remyelinering4. Att förstå mekanismerna för myelinisering vid hälsa och sjukdom är viktigt för att hitta möjliga behandlingsalternativ för demyeliniserande störningar i PNS. Myelin kan också skadas av akut neurotrauma, och metoder för att främja myelinisering för att främja funktionell återhämtning efter perifer nervskada undersöks5.
Vår kunskap om perifer myelinisering har till stor del gynnats av myeliniserande samkulturer av Schwann-celler och sensoriska neuroner. Sedan de första metoderna tillämpades 6,7,8 har myelinisering studerats intensivt med användning av olika samkultursystem9,10,11. Här tillhandahåller vi ett snabbt och enkelt protokoll för robust in vitro-myelinering av dorsalrotganglieaxoner. Protokollet för Schwann-cellberedning är baserat på protokollet av Andersen et al.12, tidigare publicerat i Pitarokoili et al.13. Vi använder Schwann-celler som härrör från unga råttor och embryonala DRG-explantkulturer för samkulturen, där myelinisering sker runt dag 14. Målet med metoden är att tillhandahålla ett system för att undersöka bildandet av myelin som ett resultat av direkt axon-Schwann-cellinteraktion, och att studera modulatorer av PNS-myelinisering. I jämförelse med dissocierade neuronala cellkulturer är DRG-explantat mer anatomiskt bevarade och bildar långa axonala processer. Kvantifiering av det myeliniserade axonområdet ger en tillräcklig avläsning för myelinisering i samkulturen. Metoden är ett värdefullt verktyg för att screena terapeutiska substanser för deras potentiella effekt på PNS-myelinisering, och kan även användas som tillägg till in vivo-studier i djurmodeller14.
Här presenterar vi ett snabbt och enkelt protokoll för generering av in vitro-myelinering genom att slå samman två separata celltypkulturer, Schwann-celler och dorsalrotganglionexplantat.
Ett kritiskt steg i protokollet är odling av DRG-explantat, särskilt under de första dagarna av kulturen. DRG är mycket ömtåliga innan ett starkt axonalt nätverk byggs och måste hanteras mycket försiktigt, till exempel när de tas ut ur inkubatorn eller vid byte av medium. DRG som lossna…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Prof. Dr. Ralf Gold och PD Dr. Gisa Ellrichmann för deras råd och stöd.
Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |