Myelinisering in vitro av perifera axoner i en samkultur av råtta dorsalrotganglion explantat och Schwannceller

Summary

I samodlingssystemet av dorsala rotganglier och Schwann-celler kan myelinering av det perifera nervsystemet studeras. Denna modell ger experimentella möjligheter att observera och kvantifiera perifer myelinisering och att studera effekterna av föreningar av intresse på myelinskidan.

Abstract

Myeliniseringsprocessen är avgörande för att möjliggöra snabb och tillräcklig signaltransduktion i nervsystemet. I det perifera nervsystemet engagerar neuroner och Schwann-celler en komplex interaktion för att kontrollera myelineringen av axoner. Störningar av denna interaktion och nedbrytning av myelinskidan är kännetecken för inflammatoriska neuropatier och förekommer sekundärt vid neurodegenerativa störningar. Här presenterar vi en samodlingsmodell av dorsala rotganglieexplantat och Schwann-celler, som utvecklar en robust myelinering av perifera axoner för att undersöka myeliniseringsprocessen i det perifera nervsystemet, studera axon-Schwann-cellinteraktioner och utvärdera de potentiella effekterna av terapeutiska medel på varje celltyp separat. Metodologiskt skördades dorsala rotganglioner av embryonala råttor (E13.5), dissocierades från sin omgivande vävnad och odlades som hela explantat i 3 dagar. Schwannceller isolerades från 3 veckor gamla vuxna råttor och ischiasnerver smältes enzymatiskt. De resulterande Schwann-cellerna renades genom magnetaktiverad cellsortering och odlades under neuregulin- och forskolinberikade förhållanden. Efter 3 dagar av dorsal root ganglion explantkultur tillsattes 30 000 Schwann-celler till en dorsal root ganglion explantat i ett medium innehållande askorbinsyra. De första tecknen på myelinisering upptäcktes på dag 10 av samodling, genom spridda signaler för myelinbasprotein vid immunocytokemisk färgning. Från dag 14 och framåt bildades myelinmantlar och förökades längs axonerna. Myelinisering kan kvantifieras genom myelinbasisk proteinfärgning som ett förhållande mellan myeliniseringsområdet och axonområdet för att ta hänsyn till skillnaderna i axonal densitet. Denna modell ger experimentella möjligheter att studera olika aspekter av perifer myelinisering in vitro, vilket är avgörande för att förstå patologin och möjliga behandlingsmöjligheter för demyelinisering och neurodegeneration vid inflammatoriska och neurodegenerativa sjukdomar i det perifera nervsystemet.

Introduction

I det perifera nervsystemet (PNS) förmedlas snabb informationstransduktion av myelinlindade axoner. Myelineringen av axoner är avgörande för att möjliggöra snabb utbredning av elektriska impulser, eftersom nervfibrernas ledningshastighet korrelerar med axondiametern och myelintjockleken¹. Sensorisk signalering från periferin till centrala nervsystemet (CNS) bygger på aktivering av första ordningens sensoriska neuroner som ligger i utvidgningar av dorsalroten, kallad dorsala rotganglier (DRG). För bildning och underhåll av myelin är kontinuerlig kommunikation mellan axoner och Schwann-celler, vilka är de myeliniserande Glia-cellerna i PNS, obligatorisk².

Många sjukdomar i PNS stör överföringen av information genom antingen primär axonal eller demyeliniserande skada, vilket resulterar i hypestesi eller dysestesi. Första ordningens sensoriska neuroner har förmågan att regenerera i viss utsträckning efter neuronal skada, genom en komplex interaktion mellan neuronen och omgivande Schwann-celler³. I detta fall kan Schwann-celler genomgå cellulär omprogrammering för att rensa axonalt såväl som myelinskräp och främja axonal regenerering, vilket resulterar i remyelinering⁴. Att förstå mekanismerna för myelinisering vid hälsa och sjukdom är viktigt för att hitta möjliga behandlingsalternativ för demyeliniserande störningar i PNS. Myelin kan också skadas av akut neurotrauma, och metoder för att främja myelinisering för att främja funktionell återhämtning efter perifer nervskada undersöks⁵.

Vår kunskap om perifer myelinisering har till stor del gynnats av myeliniserande samkulturer av Schwann-celler och sensoriska neuroner. Sedan de första metoderna tillämpades ^6,7,8 har myelinisering studerats intensivt med användning av olika samkultursystem^9,10,11. Här tillhandahåller vi ett snabbt och enkelt protokoll för robust in vitro-myelinering av dorsalrotganglieaxoner. Protokollet för Schwann-cellberedning är baserat på protokollet av Andersen et al.12, tidigare publicerat i Pitarokoili et ^al.13. Vi använder Schwann-celler som härrör från unga råttor och embryonala DRG-explantkulturer för samkulturen, där myelinisering sker runt dag 14. Målet med metoden är att tillhandahålla ett system för att undersöka bildandet av myelin som ett resultat av direkt axon-Schwann-cellinteraktion, och att studera modulatorer av PNS-myelinisering. I jämförelse med dissocierade neuronala cellkulturer är DRG-explantat mer anatomiskt bevarade och bildar långa axonala processer. Kvantifiering av det myeliniserade axonområdet ger en tillräcklig avläsning för myelinisering i samkulturen. Metoden är ett värdefullt verktyg för att screena terapeutiska substanser för deras potentiella effekt på PNS-myelinisering, och kan även användas som tillägg till in vivo-studier i djurmodeller¹⁴.

Protocol

Alla försök utfördes i enlighet med Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv för vård och användning av försöksdjur. 1. Schwann cellodling Beläggning för Schwann-cellodlingBelägg cellodlingsrätterna under sterila förhållanden. Applicera 2 ml 0,01% poly-L-lysin (PLL) på två 60 mm vävnadsodlingsrätter (TC) vardera och inkubera över natten vid 4 °C. Ta bort PLL, tvätta TC-diskarna 2x med destillerat vatten och inkubera med 2 ml 1 ?…

Representative Results

Myelinisering i samkulturen bedömdes dag 10, 12, 14, 16, 18 och 20. DRG-explantaterna och Schwann-cellerna färgades för MBP, βIII-tubulin och DAPI. Axonalnätverket i samkulturen var tätt och förändrades inte synligt under observationens tidsförlopp. De första tecknen på myelin, i form av små fragment, detekterades på dag 10 och ökade på dag 12 (figur 2). De MBP-positiva områdena ökade över tid fram till dag 20 av kulturen. Myeliniseringen kvantifierades som ett förhålland…

Discussion

Här presenterar vi ett snabbt och enkelt protokoll för generering av in vitro-myelinering genom att slå samman två separata celltypkulturer, Schwann-celler och dorsalrotganglionexplantat.

Ett kritiskt steg i protokollet är odling av DRG-explantat, särskilt under de första dagarna av kulturen. DRG är mycket ömtåliga innan ett starkt axonalt nätverk byggs och måste hanteras mycket försiktigt, till exempel när de tas ut ur inkubatorn eller vid byte av medium. DRG som lossna…

Materials

Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285