In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen

Summary

Im Kokultursystem von dorsalen Wurzelganglien und Schwann-Zellen kann die Myelinisierung des peripheren Nervensystems untersucht werden. Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten zur Beobachtung und Quantifizierung der peripheren Myelinisierung und zur Untersuchung der Auswirkungen von Wirkstoffen auf die Myelinscheide.

Abstract

Der Prozess der Myelinisierung ist essentiell, um eine schnelle und ausreichende Signalübertragung im Nervensystem zu ermöglichen. Im peripheren Nervensystem interagieren Neuronen und Schwann-Zellen in einem komplexen Zusammenspiel, um die Myelinisierung von Axonen zu steuern. Störungen dieses Zusammenspiels und der Abbau der Myelinscheide sind Kennzeichen entzündlicher Neuropathien und treten sekundär bei neurodegenerativen Erkrankungen auf. In dieser Arbeit stellen wir ein Kokulturmodell von Explantaten aus dorsalen Wurzelganglien und Schwann-Zellen vor, das eine robuste Myelinisierung peripherer Axone entwickelt, um den Prozess der Myelinisierung im peripheren Nervensystem zu untersuchen, Axon-Schwann-Zell-Interaktionen zu untersuchen und die potenziellen Auswirkungen von Therapeutika auf jeden Zelltyp separat zu bewerten. Methodisch wurden dorsale Wurzelganglien embryonaler Ratten (E13.5) geerntet, von ihrem umgebenden Gewebe dissoziiert und 3 Tage lang als ganze Explantate kultiviert. Schwann-Zellen wurden aus 3 Wochen alten erwachsenen Ratten isoliert und Ischiasnerven enzymatisch verdaut. Die resultierenden Schwann-Zellen wurden durch magnetisch aktivierte Zellsortierung gereinigt und unter Neuregulin- und Forskolin-angereicherten Bedingungen kultiviert. Nach 3-tägiger dorsaler Wurzelganglien-Explantatkultur wurden 30.000 Schwann-Zellen in einem ascorbinsäurehaltigen Medium zu einem dorsalen Wurzelganglien-Explantat hinzugefügt. Die ersten Anzeichen einer Myelinisierung wurden am 10. Tag der Kokultur durch gestreute Signale für das basische Myelinprotein in der immunzytochemischen Färbung nachgewiesen. Ab dem 14. Tag bildeten sich Myelinscheiden, die sich entlang der Axone ausbreiteten. Die Myelinisierung kann durch die Färbung des basischen Myelinproteins als Verhältnis der Myelinisierungsfläche und der Axonfläche quantifiziert werden, um die Unterschiede in der axonalen Dichte zu berücksichtigen. Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten, verschiedene Aspekte der peripheren Myelinisierung in vitro zu untersuchen, was für das Verständnis der Pathologie und der möglichen Behandlungsmöglichkeiten der Demyelinisierung und Neurodegeneration bei entzündlichen und neurodegenerativen Erkrankungen des peripheren Nervensystems von entscheidender Bedeutung ist.

Introduction

Im peripheren Nervensystem (PNS) wird die schnelle Informationstransduktion durch myelinumhüllte Axone vermittelt. Die Myelinisierung von Axonen ist essentiell, um eine schnelle Ausbreitung elektrischer Impulse zu ermöglichen, da die Leitungsgeschwindigkeit der Nervenfasern mit dem Axondurchmesser und der Myelindicke korreliert¹. Die sensorische Signalübertragung von der Peripherie zum Zentralnervensystem (ZNS) beruht auf der Aktivierung sensorischer Neuronen erster Ordnung, die sich in Vergrößerungen der dorsalen Wurzel befinden, die als dorsale Wurzelganglien (DRG) bezeichnet werden. Für die Bildung und Aufrechterhaltung von Myelin ist eine kontinuierliche Kommunikation zwischen Axonen und Schwann-Zellen, den myelinisierenden Gliazellen im PNS, unerlässlich².

Viele Erkrankungen des PNS stören die Informationsweiterleitung entweder durch primäre axonale oder demyelinisierende Schäden, was zu Hypästhesien oder Dysästhesien führt. Sensorische Neuronen erster Ordnung haben die Fähigkeit, sich nach einer neuronalen Schädigung durch eine komplexe Interaktion zwischen dem Neuron und den umgebenden Schwann-Zellen bis zu einem gewissen Grad zu regenerieren³. In diesem Fall können Schwann-Zellen eine zelluläre Reprogrammierung durchlaufen, um sowohl axonale als auch myelinale Trümmer zu beseitigen und die axonale Regeneration zu fördern, was zu einer Remyelinisierung führt⁴. Es ist wichtig, die Mechanismen der Myelinisierung in Gesundheit und Krankheit zu verstehen, um mögliche Behandlungsoptionen für demyelinisierende Störungen des PNS zu finden. Myelin kann auch durch ein akutes Neurotrauma geschädigt werden, und Ansätze zur Förderung der Myelinisierung zur Förderung der funktionellen Erholung nach peripheren Nervenverletzungen werden untersucht⁵.

Unser Wissen über die periphere Myelinisierung hat weitgehend von myelinisierenden Kokulturen von Schwann-Zellen und sensorischen Neuronen profitiert. Seit der Anwendung der ersten Ansätze ^6,7,8 wurde die Myelinisierung unter Verwendung verschiedener Kokultursysteme intensiv untersucht^9,10,11. Hier stellen wir ein schnelles und einfaches Protokoll für eine robuste in vitro Myelinisierung von Axonen der dorsalen Wurzelganglien zur Verfügung. Das Protokoll für die Schwann-Zellpräparation basiert auf dem Protokoll von Andersen et al.12, das zuvor in Pitarokoili et ^al.13 veröffentlicht wurde. Wir verwenden Schwann-Zellen von juvenilen Ratten und embryonale DRG-Explantatkulturen für die Kokultur, bei der die Myelinisierung etwa am 14. Tag stattfindet. Ziel der Methode ist es, ein System zur Verfügung zu stellen, mit dem die Bildung von Myelin als Folge der direkten Axon-Schwann-Zell-Interaktion untersucht und Modulatoren der PNS-Myelinisierung untersucht werden können. Im Vergleich zu dissoziierten neuronalen Zellkulturen sind DRG-Explantate anatomisch besser erhalten und bilden lange axonale Fortsätze. Die Quantifizierung des myelinisierten Axonbereichs liefert einen ausreichenden Messwert für die Myelinisierung in der Kokultur. Die Methode ist ein wertvolles Werkzeug, um therapeutische Verbindungen auf ihre potenzielle Wirkung auf die PNS-Myelinisierung zu untersuchen, und kann auch zusätzlich zu In-vivo-Studien in Tiermodellen eingesetzt werden¹⁴.

Protocol

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften über die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. 1. Schwann-Zellkultur Beschichtung für Schwann-ZellkulturBeschichten Sie die Zellkulturschalen unter sterilen Bedingungen. Tragen Sie 2 ml 0,01 % Poly-L-Lysin (PLL) auf je zwei 60-mm-Gewebekulturschalen (TC) auf und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Entfernen Sie die PLL, …

Representative Results

Die Myelinisierung in der Kokultur wurde an den Tagen 10, 12, 14, 16, 18 und 20 beurteilt. Die DRG-Explantaten und Schwann-Zellen wurden auf MBP, βIII-Tubulin und DAPI gefärbt. Das axonale Netzwerk in der Kokultur war dicht und veränderte sich im zeitlichen Verlauf der Beobachtung nicht sichtbar. Die ersten Anzeichen von Myelin in Form von kleinen Fragmenten waren an Tag 10 nachweisbar und nahmen an Tag 12 zu (Abbildung 2). Die MBP-positiven Bereiche nahmen im Laufe der Zeit bis zum 20. T…

Discussion

In dieser Arbeit stellen wir ein schnelles und einfaches Protokoll für die Generierung von in vitro Myelinisierung vor, indem zwei separate Zelltypkulturen, Schwann-Zellen und dorsale Wurzelganglien-Explantate, zusammengeführt werden.

Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die Kultivierung von DRG-Explantaten, insbesondere in den ersten Tagen der Kultur. DRG sind sehr fragil, bevor ein starkes axonales Netzwerk aufgebaut ist, und müssen sehr vorsichtig gehandhabt werden, z. B. b…

Materials

Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285