Summary
ここでは、細菌の特性評価のための簡単で迅速な方法としての原子間力顕微鏡(AFM)の応用を紹介し、細菌のサイズと形状、細菌培養バイオフィルム、殺菌剤としてのナノ粒子の活性などの詳細を分析します。
Abstract
電子顕微鏡は、細胞構造を特徴付けるために必要なツールの1つです。しかし、観察のための試料調製のため、手順は複雑で費用がかかります。原子間力顕微鏡(AFM)は、3次元での分解能が高く、真空やサンプルの導電率を必要としないため、非常に有用な特性評価技術です。AFMは、さまざまなトポグラフィーとさまざまな種類の材料でさまざまなサンプルをイメージングできます。
AFMは、オングストロームレベルからミクロンスケールまでの高解像度の3Dトポグラフィー情報を提供します。従来の顕微鏡とは異なり、AFMはプローブを使用してサンプルの表面トポグラフィーの画像を生成します。このプロトコルでは、このタイプの顕微鏡の使用は、支持体上に固定された細菌の形態学的および細胞損傷の特性評価のために示唆されている。 黄色ブドウ 球菌(ATCC 25923)、 大腸菌 (ATCC 25922)、および シュードモナス・フナネンシス (ニンニク球根サンプルから分離)の株を使用しました。この研究では、細菌細胞を特定の培地で増殖させました。細胞の損傷を観察するために、 黄色ブドウ 球菌と 大腸菌 を異なる濃度のナノ粒子(NP)とともにインキュベートしました。
一滴の細菌懸濁液をガラス支持体上に固定し、AFMを用いて異なるスケールで画像を撮影した。得られた画像は、細菌の形態学的特徴を示した。また、AFMを採用して、NPsの効果による細胞構造の損傷を観察することができた。 得られた画像に基づいて、接触AFMを使用して、支持体上に固定された細菌細胞の形態を特徴付けることができる。AFMは、細菌に対するNPの影響を調査するための適切なツールでもあります。電子顕微鏡と比較して、AFMは安価で使いやすい技術です。
Introduction
さまざまな細菌の形は、17世紀にアントニーファンレーウェンフックによって最初に注目されました1。細菌は古来より球体から枝分かれ細胞まで多種多様な形で存在してきました2。細胞の形状は、細菌分類学者が各細菌種を記述および分類するための基本的な条件であり、主にグラム陽性門とグラム陰性門3の形態学的分離のために。細菌の細胞形態を決定するいくつかの要素が知られており、そのすべてが細胞壁および膜の構成要素として、ならびに細胞骨格において細胞カバーおよび支持体に関与している。このようにして、科学者たちは、細菌の形状を定義する遺伝子のクラスターによって定義される細菌細胞の形態を決定することに関係する化学的、生化学的、物理的メカニズムとプロセスをまだ解明しています2,4。
さらに、科学者たちは、この細胞の形状が細胞の重要なパラメータで最適に見えるため、桿体の形状が細菌細胞の祖先の形態である可能性が高いことを示しました。したがって、球菌、らせん状、ビブリオ状、糸状、およびその他の形態は、さまざまな環境への適応と見なされます。実際、特定の形態は独立して何度も進化しており、細菌の形状が特定の環境に適応している可能性があることを示唆しています3,5。しかし、細菌の細胞のライフサイクルを通じて、細胞の形状が変化し、これは有害な環境条件に対する遺伝的応答としても発生します3。細菌細胞の形状とサイズは、細菌の剛性、堅牢性、および表面対体積比を強く決定し、この特性はバイオテクノロジープロセスに利用できます6。
電子顕微鏡は、光ベースの顕微鏡を超えて到達できる高倍率のために、生物学的サンプルを研究するために使用されます。透過型電子顕微鏡(TEM)と走査型電子顕微鏡(SEM)は、この目的のために最も一般的に使用される技術です。ただし、サンプルは、適切な画像を取得するために、顕微鏡のチャンバーに入れる前にいくつかの処理が必要です。サンプルには金のカバーが必要であり、画像全体の取得に使用される時間は長すぎないようにする必要があります。対照的に、原子間力顕微鏡(AFM)は、表面の分析に広く使用されている技術ですが、生物学的サンプルの研究にも採用されています。
表面分析で使用されるAFMモードには、接触モード、非接触モードまたはタッピング、磁力顕微鏡(MFM)、導電性AFM、圧電力顕微鏡(PFM)、ピーク力タッピング(PFT)、接触共振、力量など、いくつかのタイプがあります。各モードは材料の分析に使用され、材料の表面とその機械的および物理的特性に関するさまざまな情報を提供します。しかしながら、PFTは液体培地7中の細胞に関する地形的および機械的データを得ることを可能にするので、PFTのようないくつかのAFMモードはin vitroでの生物学的試料の分析に使用される。
この作業では、すべての古くてシンプルなAFMモデルに含まれる最も基本的なモードであるコンタクトモードを使用しました。AFMは、鋭利なプローブ(直径約<50 nm)を使用して、100 μm未満の領域をスキャンします。プローブは、サンプルに関連する力場と相互作用するためにサンプルに位置合わせされます。表面はプローブでスキャンされ、力を一定に保ちます。次に、カンチレバーが表面を横切って移動するときのカンチレバーの動きを監視することにより、表面の画像が生成されます。収集された情報は、接着性、弾性、粘度、せん断などの表面のナノ機械的特性を提供します。
AFM接触モードでは、カンチレバーは一定のたわみでサンプル全体をスキャンされます。これにより、サンプルの高さ(Z)を決定することができ、これは他の電子顕微鏡技術よりも優れています。AFMソフトウェアは、先端と試料表面の相互作用による3D画像スキャンの生成を可能にし、先端のたわみはレーザーと検出器を介して試料の高さと相関します。
一定の力を持つ静的モード(接触モード)では、出力は高さ(z地形)とたわみまたはエラー信号の2つの異なる画像を表示します。静的モードは、特に静的モードによって加えられる高負荷とねじり力を処理できる空気中の堅牢なサンプルにとって、貴重でシンプルなイメージングモードです。たわみまたは誤差モードは、定力モードで動作します。しかしながら、トポグラフィ画像は、表面構造に偏向信号を加えることによってさらに強調される。このモードでは、たわみはフィードバックパラメータであるため、たわみ信号はエラー信号とも呼ばれます。このチャネルに現れる特徴や形態は、フィードバックループの「エラー」によるものか、一定のたわみ設定値を維持するために必要なフィードバックループによるものです。
AFMのユニークな設計により、コンパクトになり、卓上に収まるほど小さく、原子ステップを解決するのに十分な高解像度を実現しています。AFM装置は、他の電子顕微鏡用の装置よりも低コストであり、メンテナンスコストは最小限です。顕微鏡は、クリーンルームや隔離されたスペースなどの特別な条件を備えたラボを必要としません。必要なのは振動のないデスクだけです。AFMの場合、サンプルは他の技術(金カバー、痩身)のように精巧な準備をする必要はありません。サンプルホルダーには、乾燥サンプルのみを取り付ける必要があります。
AFM接触モードを用いて、細菌の形態やNPの影響を観察しています。支持体上に固定された細菌の集団および細胞形態、ならびに細菌種上のナノ粒子によって生じる細胞損傷を観察することができる。AFMコンタクトモードで得られた画像は、AFMが強力なツールであり、試薬や複雑な手順に制限されないことを確認し、細菌の特性評価のためのシンプルで高速かつ経済的な方法になります。
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Protocol
1.細菌の分離と同定
- ニンニク球根分裂組織からの内生株の単離:
- 以前に皮をむき、消毒し、カットしたニンニクの球根から2 mmの分裂組織の断片を、豊富な増殖培地としてトリプチカーゼ大豆寒天培地(TSA)に置き、25°Cで1日間インキュベートします。
- 細菌コロニーの形態学的違い(形状、サイズ、色、エッジ、透過光、反射光、テクスチャー、粘稠度、および色素産生)に基づいて、観察されたさまざまな形態型を記述し、各形態型の代表的なコロニーを交差ストリーキングすることによって精製します。
- 精製されたすべての細菌株を-80°Cの30%グリセロールで保存します。
- 16S rDNAのシーケンシングにより、無作為に選択した株(9AP)を同定します。ホフマンとウィンストン8の方法に従ってDNAを抽出します。
- 100 ng の DNA、1 x ポリメラーゼバッファー、4 mM MgCl2、0.4 mM dNTP、27F/1492r ユニバーサルオリゴヌクレオチド各 10 pmol、および 1 U の DNA ポリメラーゼ9 を用いたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) により、16S rRNA を増幅します。次のサーマルサイクラー条件を使用します:最初の変性のために5分間95°C。続いて、脱変性温度として94°Cで1分、ハイブリダイゼーション温度として56°Cで1分、伸長温度として72°Cで1分の35サイクル;その後、最終伸長として72°Cで10分間行った。
- 同じオリゴヌクレオチドを用いたPCR産物のキャピラリー配列;キャピラリーシーケンシング10用のマトリックスインストールキットとともにジデオキシターミナル法を使用し、自動マルチキャピラリーシステム11で電気泳動を実行します。
- 配列を手動で編集し、BLAST検索を使用して配列をGenBankライブラリと比較し、最も近い種12,13と少なくとも98.7%の同一性のゴールドスタンダードで株を暫定的に特定します。
注:株9APは、株P.フナネンシスLV(JX545210)の配列と99.86%の同一性で、シュードモナス・フナネンシスの種に属すると同定されました。
2. AFMによる形態観察のための細菌試料調製
- 無菌条件下で、細菌懸濁液(シュードモナス・フナネンシス、 黄色ブドウ球菌) を一滴ガラススライド上に置きます。
- 乾式加熱によりサンプルをスライドに固定します。サンプルが乾くまで、スライドを炎の上に数回静かに通します。
注:サンプルの固定は、固定された原核生物を観察し、生細胞としての構造を可能な限りシミュレートするための微生物学における日常的な技術です。 - 固定したサンプルをシャーレに入れ、AFM装置に持って行って観察します。
注意: サンプルは時間の経過とともに気象条件によって変化する可能性があるため、AFM機器での分析には最大24時間を確保してください。サンプルにほこりがないようにしてください。
3. MgOナノ粒子の細菌に対する抗菌効果
注:MgO NPの合成と特性評価は以前に公開されています14。この研究では、ナノ材料の抗菌活性を、阻害のためのマクロ希釈および微量希釈法を使用して、臨床検査基準研究所(CLSI)のマニュアルに基づいて推定しました15,16。
- 最小阻害活性(MIC)および殺菌剤(CMB)の推定
- 菌株の予備増殖
- 適量の大腸菌または黄色ブドウ球菌を栄養価の高いブロスに接種して、最終濃度1 × 108 CFU / mLにします。
- 懸濁液を37°C(± 2°C)で18〜24時間インキュベートします。
- 順応株の増殖後
- 滅菌細菌学的ループを懸濁液に浸し、チューブの底に触れます。
- エオジンとメチレンブルー寒天と栄養寒天にループでストリーキングを行います。
- 寒天プレートを37°C(± 2°C)で24時間インキュベートします。
- 標準化接種材料の調製のためのコロニーの選択
- 細菌学的ループでペトリ皿のコロニーの上部に触れることにより、同じ形態学的タイプのコロニーを3〜5個取ります。
- 選択範囲を移し、3〜5 mLのミュラーヒントンブロスに浸します。
- 37 °C(± 2 °C)でインキュベートして、濁度を1 × 108 CFU/mLまたは2 × 108 CFU/mLにします。
注:この研究では、マクファーランド濁度基準が細菌学的懸濁液の基準として使用されました。具体的には、0.5標準は、1.5 ×10 8細胞/mLの均一な大腸菌懸濁液にほぼ対応します。UV-Vis分光光度計を用いて濁度を測定した。 - 1 mLを取り、9 mLの滅菌ブロスに加えます。この希釈液200 μLを取り、19.8 mLの滅菌ブロスに加えて、最終濃度5 ×10 5 CFU / mLを得ます。
- MgOナノ粒子の必要濃度
- 溶液の調製のために超音波装置を使用する。
- ナノ材料を滅菌水に懸濁し、連続溶液を得るのに必要な濃度の2倍にします。
- これらの懸濁液をミュラーヒントンブロスを含む滅菌チューブに加えて、実験に必要な新しい濃度範囲を実現します。
注:次のMgO NPs濃度を微量希釈に適用しました:30 ppm、60 ppm、120 ppm、250 ppm、500 ppm、1,000 ppm、2,000 ppm、3,000 ppm、4,000 ppm、および8,000 ppm。
- 微量希釈液15の調製
- 新しい滅菌済みの96ウェルマイクロタイタープレート(マイクロプレート)を準備します。マイクロプレートのカラム番号12を無菌カラムとして標識;カラム番号11を成長制御カラムとして標識した。
- 異なる濃度のナノ粒子懸濁液120 μLをカラムNo.1-10に加えます。
- 120 μL の細菌 (5 × 105 CFU/mL) をカラム No.1-10 のウェルに接種します。
注:この研究では、行Gと行Hは、CLSI標準で示唆されている濃度のセフトリアキソンを含む対照でした:8 ppm、4 ppm、2 ppm、1 ppm、0.5 ppm、0.25 ppm、0.125 ppm、0.06 ppm、および0.03 ppm。 - 96ウェルマイクロプレートを37°C(35°C±2°C)で24時間インキュベートします。最後に、井戸を分析します。
- 菌株の予備増殖
- MgOナノ粒子による細菌株の形態構造変化のAFMによる観察
- 微量希釈試験のウェルから250 μLを取り出し、750 μLの滅菌水と混合し、2,000 × gで5°Cで2分から5分間遠心分離します。
- 沈殿物を毎回1 mLの滅菌水で3回洗浄し、洗浄の最後に500 μLの水を加えます。
- AFM画像を取得するには、各スターティングウェルの最終懸濁液を10〜20μL採取し、以前に超音波で洗浄したスライドに塗抹標本を行い(30分)、室温で1時間乾燥させます。
4. AFM測定
注:ここでは、接触モードの原子間力顕微鏡を防振ワークステーションに取り付け、顕微鏡を機械的振動源から隔離し、システムを水平に保ちました。電気的干渉は、ラインフィルタとサージ保護によって減少します。ここで使用されるAFMは、レーザービームを光検出器に自動位置合わせします。
- コンピュータとAFMの電源を入れ、ソフトウェアツールで コンタクトモード、 contAI-Gプローブ、および 自動スロープ オプションを選択します。Zコントローラのデフォルト値は、 セットポイント = 20nM、Pゲイン = 10,000、Iゲイン = 1,000、 Dゲイン = 0、 チップ電圧 = 0 mVです。
- 70 μmのスキャンレンジヘッドを使用して、サンプルをAFMコンタクトモードにします。バネ定数が0.13 N/mのContAI-Gシリコンカンチレバーを使用しました。
- スキャンヘッドに組み込まれた2つのレンズに取り付けられたカメラデバイスを使用して、プローブの下の領域の表面をすばやく表示します。
- 目的の領域を選択するために、XY平面で変位を手動で実行します。プローブは、接触条件に達するまで表面サンプルに電子的に近づくように作られています。XY方向の傾きを小さくすることで、スキャナーとサンプル表面のXY測定面を電子的に調整します。
- ソフトウェアの標準パラメータを使用します:1行あたり 256ポイントで1秒あたり1行。
- まず、70 μm x 70 μmの領域のフルスキャン範囲を実行します。次に、 ズームツールを使用してより小さな領域を選択します。AFMは、Z単位のチャート範囲を自動的に最適化します。
注意: ライン/秒の時間を減らすと、合計スキャン時間が長くなり、スキャンの品質がより明確になり、測定からのノイズも除去されます。 - サンプルから新しい領域を選択するには、カンチレバーを電子的に収縮させ、サンプルをXY平面に沿って移動します。手順 4.5 および手順 4.6 で説明されている手順を使用して、新しいスキャンを実現します。
注:得られたスキャンは単色のバースケールで表示され、明るい色はより高い高度に関連付けられ、暗い色はより深い高度に関連付けられます。AFMソフトウェアは、測定された表面の詳細を把握できるスキャンの3Dビューを生成します。 - フィルター選択の画像の [ツール] メニューの行ごとの レベリングを使用してデータ処理を実行します。これは、最も使用され、最も単純なレベリング方法です。
注:このレベリング方法は、AFM画像で生成されたすべての水平または垂直線を取得し、それを多項式に適合させます。 - 最適な画像解像度を得るために、右側のカラーバーの最大高さと最小高さを最適化します。
- ツールバーの [ 解析 ] メニューを使用して、画像解析を実行します。目的のツールを選択したら、最初と最後のポイントを選択して、高さと距離を決定します。
注: ユーザーは、レベリング プロセスで使用される平坦化によるヒント イメージのアーティファクトを回避するために、[ ツール ] メニューのさまざまなフィルターを試す必要があります。画像アーティファクトは縞線として表示され、一部のAFM画像に表示されます。
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Representative Results
黄色ブドウ球菌株とP. hunanensis株の形態とサイズの画像、および両方の株の集団構成を、接触モードで原子間力顕微鏡で撮影しました。黄色ブドウ球菌の画像は、その個体群が球菌の集合体を持つゾーンによって分布していることを示しました(図1A)。規模が大きくなるにつれて、球菌の個体群分布と形態に対する認識が高まりました(図1B)。顕微鏡検査の報告は、黄色ブドウ球菌の隣接する細胞に疑似半球構造が存在することを示しましたが、一般に、AFM画像で以前に示されているように、細菌は細胞分裂後に球菌の形で球状の形態を示しました。さらに、AFM接触モード画像により、球菌のサイズを決定することができ、平均幅は1.25μmでした。20個のセルの測定から得られた値を図2に示す。
P. hunanensisの場合、ガラス支持体の表面全体に均一な分布が観察され、支持体に付着する細菌単層を形成し(図3A)、Zuttionらによって報告され、著者らはP. aureginosaを固体支持体に固定化し、同じ挙動を示した。シュードモナス・フナネンシス菌は、長さ1.9 μm(L)、幅0.9 μm(W)の棒状であることが観察されました(図3B、C)。これらのデータは、1.5-2.0 μm(L)および0.6-0.9 μm(W)のP.蛍光について報告された値の範囲内である17,18,19。
MgO NPsの相互作用による形態構造変化を可視化するために、細菌株を処理(微量希釈)後にAFM分析に供した。図4と図5に3つのグループを示しています:図4A-Cと図5A-Cはコントロールです。図4D-Fおよび図5D-Fの画像は、MICでの微量希釈の結果から得られたものです。図4G-Iおよび図5G-Iの画像は、MICよりも高濃度で得られた。
図4A〜Cの上群の画像は、滑らかな表面と均質な輪郭を有する黄色ブドウ球菌の球菌型細胞を示しており、マイクロ希釈技術に従ってMüeller-Hintonブロス中の適切な環境で24時間増殖した。平均直径は1μm±0.15μmであった。この直径は、図4D-Fに示すようにNP処理後に実質的に消失し、細胞構造の劣化が非常に激しかったためである。断面によると、対照の平均高さは200nm±50nmであった。処理した細胞の高さは、対照に対して40%(120nm±5nm)減少した。画像は、粒子のCMIにおけるMgO NPへの曝露後の小胞の形成などの表面の変化を明確に示しています。さらに、濃度を2倍にすることにより、図4G-I 20,21の画像に示すように、細胞構造の内部状態が影響を受け、細胞質物質が放出されました。
これらの変化は、図5に示すように、黄色ブドウ球菌と同様の条件で大腸菌細胞でも確認されました。この細菌の対照は滑らかな表面を示し、明らかな変化なしにその非常に均質な棒状形状(バチルス)を強調した。3次元画像は、微生物に関連する最も高い地形領域を白で示しています。対照大腸菌の平均高さは160nm±50nmであり、断面画像によれば、500ppmの濃度のMgOナノ粒子(MIC)に24時間曝露された細胞の平均高さは10nm±76nmに減少した。構造は1,000ppmの濃度で完全に消失し、細菌のシルエットのみを区別することができました。両方の濃度の画像を分析したところ、対照に関しては、図5D-Iの画像に示すように、処理された細胞の細胞形態が有意に変化し、2.0μm±0.5μm(図5A-C)から3.0μm±0.3μmの伸長が観察された。この増加は、細胞構造が内部の恒常性を失い、構造崩壊を引き起こしたときに明らかでした20,22。MgO NPに曝露された細菌の画像は、両方のMICで、濃度を2倍にした場合に、隆起形成や波形などの表面変化をはっきりと示しました20,22。
図1:黄色ブドウ球菌の原子間力顕微鏡接触モード。 この図は、黄色ブドウ球菌から採取した地形を、(A)70 μmと(B)5.0 μmの異なるスケールで示しています。マッピングエリアは、黄色ブドウ球菌の地形を取得するために選択されました。画像Bは明らかに黄色ブドウ球菌を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 黄色ブドウ球菌の原子間力顕微鏡コンタクトモードトポグラフィーとヒストグラム。 画像は、(A)トポグラフィーと(B)熱固定手順を使用してガラス支持体に固定された 黄色ブドウ球菌 の直径のヒストグラムを示しています。セル径はAFMソフトウェアで測定しました。n = 20。画像は測定値を表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:シュードモナス・フナネンシス1AP-CYの原子間力顕微鏡接触モード。この図は、P. hunanensis 1AP-CYから、(A)70 μm、(B)20 μm、(C)5.0 μmの異なるスケールで撮影された地形を示しています。さまざまな縮尺の画像は、スライド上の細胞集団の分布を示しています。細胞の形態を解析するために、P. hunanensisの桿体形状を示す画像Bに示すように、集団密度の低い領域に焦点を当てます(トポグラフィー画像を強調するためにたわみ信号が示されています)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.未処理の黄色ブドウ球菌(上)および黄色ブドウ球菌を250ppmおよび500ppmのMgOナノ粒子(中央および下部)に24時間曝露したAFMコンタクトモード画像。(A,D,G)地形画像;(B、E、H)3次元画像;(C、F、I)断面画像。MgOの最小発育阻止濃度(250ppm)とより高い濃度(500ppm)を採用した場合、細菌の構造変化が観察されました。偏向信号は、トポグラフィー画像を強調するために示されます。図4A,D,GはMuñiz Diazら14によるものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:未処理の大腸菌(上)および500ppmおよび1,000ppmのMgOナノ粒子(中央および下)に24時間曝露された大腸菌について得られたAFM接触モード画像(A、D、G)トポグラフィー画像。(B、E、H)3次元画像;(C、F、I)断面画像。MgOの最小発育阻止濃度(500 ppm)と高濃度(1,000 ppm)を採用した場合、細菌の構造変化が観察されました。図5A、D、GはMuñiz Diazら14からのものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
顕微鏡法は、生物学的サンプルの構造、サイズ、形態、および細胞配置の調査を可能にする生物学実験室で一般的に使用される技術です。この技術を改善するために、機器の分解能を決定する光学的または電子的特性の点で互いに異なるいくつかのタイプの顕微鏡を使用することができる。
科学研究では、細菌細胞の特性評価には顕微鏡の使用が必要です。例えば、顕微鏡検査は、NaClが大腸菌株の熱抵抗と細胞形態に影響を与えること、チョウセンゴミシ抽出物が黄色ブドウ球菌に対して抗菌効果を示すこと、黄色ブドウ球菌が致死性熱ショック後に耐熱性を発達させること、および大腸菌のバイオミネラル化が白金23,24,25,26,27 .このように、AFMによって提示された利点は、環境と生物学の研究分野への拡大を可能にしました。
原子間力顕微鏡は、その 場で 細菌を分析するために接触モードで使用される装置であり、マクロおよびナノスコピック材料のトポグラフィーを決定するために非接触モードで使用される装置です。他の技術に対するAFMの利点は、地形画像を取得するために必要なサンプルが少ないことです。また、非破壊技術と見なされ、分析された画像の構造を損傷したり損なったりすることはありません。このプロトコルでは熱固定を使用しましたが、細菌細胞の形態は変化しませんでした。この技術は、細菌の形態を研究するために微生物学研究室で一般的に使用されていることに言及することが重要です。植物や動物の組織サンプルとは異なり、熱固定技術は、組織の劣化に現れるタンパク質と脂質の変化を引き起こします。細菌では、この技術は細胞のわずかな収縮を引き起こし、細胞の形状の観察と識別を妨げません。
AFMを使用すると、サンプルの調製が容易で、電子顕微鏡の場合のように化学製品を必要とせず、機器から放出された電子とサンプルの相互作用によって画像が生成されるため、分析するサンプルが導電性であることが不可欠である。サンプルが導電性でない場合は、物理蒸着技術を使用して金などの導電性要素で金属化する必要があります。さらに、電子顕微鏡の分解能は、レンズとモデルに応じて最大0.4 nmに達しますが、接触モードのAFMはマイクロメートル、ナノメートル、さらにはピコメートルの分解能に達する可能性があり、電子顕微鏡22と競合します。電子顕微鏡に対するAFMの別の利点は、試料処理のために高真空条件を必要としないことである20、21。一般的に使用される技術に対するAFMの他の利点は、低コストで短い画像取得時間です。
細菌サンプルをガラス板に固定する技術に関しては、熱固定が微生物学研究室で一般的に使用される技術であることに言及することが重要です。この技術は、細菌サンプルを単純染色または差動染色で識別できるようにするために使用されます。同時に、細菌、一般的に球菌または桿体の形状が見られます。熱固定技術の不利な点は細菌のサイズの減少であるが、この技術は細菌の形状を損なうことはない。
固定後、細胞サイズの大幅な減少として現れる可能性のあるサンプルの老化を避けるように注意する必要があります。したがって、固定から24時間以内にサンプルを分析することをお勧めします。サンプルがほこりにさらされないように注意する必要もあります。したがって、サンプルは密閉容器(ペトリ皿など)に保管する必要があります。これらの条件は、得られるAFM画像を変化させる可能性があるため、非常に重要です。
細菌のサイズを小さくすることは、いくつかの研究作業に影響を与える可能性があること、および細菌を支持体に付着させる他の方法が必要になる可能性があることは明らかです。例えば、34 mmプレート上のBMブロスで増殖させた黄色ブドウ球菌バイオフィルムは、グリセルアルデヒドで固定されています。さらに、黄色ブドウ球菌はポリ-l-リジンで処理したV字型カンチレバーで固定化されており、C.アルビカンスでは、非生物表面への接着中の吸着血清タンパク質の交換を分析するために、正に帯電したポリ-l-リジンでコーティングされたスライドガラスに菌糸を固定しています28,29。
この研究では、サンプルを熱固定しても細菌によって形成された形状や凝集体は変化せず、熱固定によりナノ粒子の効果を視覚化することができました。したがって、AFMトポグラフィーは、単離された球菌または 黄色ブドウ球 菌の凝集体および P. hunanensis の桿体の形状を示す可能性があります(図1 および 図3)。また、 黄色ブドウ球菌 と 大腸菌 はMgOナノ粒子の影響により構造に損傷を与えたのに対し、対照試料(ナノ粒子なし)では形態に変化は見られなかったこともわかりました(図4 、 図5)。
この研究は、AFM接触モードの使用が、黄色ブドウ球菌、P. hunanensis、および大腸菌で示されているように、生物学的サンプルの表面トポロジーと欠陥を特徴付けるための実行可能な代替手段であることを示しています。さらに、熱固定技術は、細胞表面を変化させ、分析を妨げる決定要因ではありません。控えめに言って、熱固定がAFMの使用において利点である可能性があることを示唆することができます。サンプルの処理が少なくなり、化学試薬の使用が回避されます。したがって、この方法論は単純で経済的な手法です。これは、バイオフィルムと細菌の接着の研究に示されているように、実行される特定の分析に応じて変化する可能性があることに言及する価値があります28,29。この研究の可能な拡張として、接触モードAFMは、他の医学的に重要な細菌に対するNPの影響を分析するため、または細胞損傷が観察される研究において使用することができる。
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Disclosures
著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
ラミロ・ムニス・ディアスは、CONACyTの奨学金に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
References
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