Summary
Här presenterar vi tillämpningen av atomkraftmikroskopi (AFM) som en enkel och snabb metod för bakteriell karakterisering och analyserar detaljer som bakteriestorlek och form, bakteriekulturbiofilmer och nanopartiklars aktivitet som bakteriedödande medel.
Abstract
Elektronmikroskopi är ett av de verktyg som krävs för att karakterisera cellulära strukturer. Förfarandet är emellertid komplicerat och dyrt på grund av provberedningen för observation. Atomkraftmikroskopi (AFM) är en mycket användbar karakteriseringsteknik på grund av dess höga upplösning i tre dimensioner och på grund av avsaknaden av krav på vakuum och provledningsförmåga. AFM kan avbilda en mängd olika prover med olika topografier och olika typer av material.
AFM ger högupplöst 3D-topografiinformation från ångströmnivå till mikronskala. Till skillnad från traditionell mikroskopi använder AFM en sond för att generera en bild av yttopografin i ett prov. I detta protokoll föreslås användningen av denna typ av mikroskopi för morfologisk och cellskada karakterisering av bakterier fixerade på ett stöd. Stammar av Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) och Pseudomonas hunanensis (isolerade från vitlökslökprover) användes. I detta arbete odlades bakterieceller i specifika odlingsmedier. För att observera cellskador inkuberades Staphylococcus aureus och Escherichia coli med olika koncentrationer av nanopartiklar (NP).
En droppe bakteriesuspension fixerades på ett glasstöd, och bilder togs med AFM i olika skalor. De erhållna bilderna visade bakteriens morfologiska egenskaper. Vidare, med hjälp av AFM, var det möjligt att observera skadorna på den cellulära strukturen orsakad av effekten av NP. Baserat på de erhållna bilderna kan kontakt-AFM användas för att karakterisera morfologin hos bakterieceller fixerade på ett stöd. AFM är också ett lämpligt verktyg för undersökning av effekterna av NP på bakterier. Jämfört med elektronmikroskopi är AFM en billig och lättanvänd teknik.
Introduction
Olika bakterieformer noterades först av Antony van Leeuwenhoek på 17-talet1. Bakterier har funnits i en stor mångfald av former sedan antiken, allt från sfärer till förgreningsceller2. Cellform är ett grundläggande villkor för bakteriella taxonomer att beskriva och klassificera varje bakterieart, främst för morfologisk separation av gram-positiv och gramnegativ phyla3. Flera element är kända för att bestämma bakteriella cellformer, som alla är involverade i cellöverdrag och stöd som komponenter i cellväggen och membranet, liksom i cytoskelettet. På detta sätt belyser forskare fortfarande de kemiska, biokemiska och fysiska mekanismer och processer som är inblandade i att bestämma bakteriella cellformer, som alla definieras av kluster av gener som definierar bakterieformer 2,4.
Dessutom har forskare visat att stavformen sannolikt är den förfäderliga formen av bakterieceller, eftersom denna cellform verkar optimal i cellsignifikanta parametrar. Således betraktas kocker, spiral, vibrio, filamentösa och andra former som anpassningar till olika miljöer; Faktum är att vissa morfologier har utvecklats oberoende flera gånger, vilket tyder på att bakteriernas former kan anpassas till särskilda miljöer 3,5. Men under hela bakteriecellens livscykel förändras cellformen, och detta sker också som ett genetiskt svar på skadliga miljöförhållanden3. Bakteriecellens form och storlek bestämmer starkt bakteriens styvhet, robusthet och förhållande mellan yta och volym, och denna egenskap kan utnyttjas för biotekniska processer6.
Elektronisk mikroskopi används för att studera biologiska prover på grund av den höga förstoringen som kan nås bortom ljusbaserade mikroskop. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) och svepelektronmikroskopi (SEM) är de vanligaste teknikerna för detta ändamål; Prover kräver dock vissa behandlingar innan de placeras i mikroskopets kammare för att få lämpliga bilder. Ett guldskydd på proverna krävs, och den tid som används för total bildförvärv bör inte vara för lång. Däremot är atomkraftmikroskopi (AFM) en teknik som ofta används vid analys av ytor men används också vid studier av biologiska prover.
Det finns flera typer av AFM-lägen som används vid ytanalys, såsom kontaktläge, beröringsfritt läge eller tappning, magnetisk kraftmikroskopi (MFM), ledande AFM, piezoelektrisk kraftmikroskopi (PFM), toppkrafttappning (PFT), kontaktresonans och kraftvolym. Varje läge används vid analys av material och ger olika information om materialens yta och deras mekaniska och fysikaliska egenskaper. Vissa AFM-lägen används emellertid för analys av biologiska prover in vitro, såsom PFT, eftersom PFT möjliggör erhållande av topografiska och mekaniska data om celler i ett flytande medium7.
I det här arbetet använde vi det mest grundläggande läget som ingår i varje gammal och enkel AFM-modell - kontaktläget. AFM använder en skarp sond (cirka <50 nm i diameter) för att skanna områden mindre än 100 μm. Sonden justeras mot provet för att interagera med kraftfälten som är associerade med provet. Ytan skannas med sonden för att hålla kraften konstant. Därefter genereras en bild av ytan genom att övervaka utskjutarens rörelse när den rör sig över ytan. Den insamlade informationen ger ytans nanomekaniska egenskaper, såsom vidhäftning, elasticitet, viskositet och skjuvning.
I AFM-kontaktläget skannas utskjutaren över provet med en fast avböjning. Detta gör att man kan bestämma höjden på proverna (Z), och detta utgör en fördel jämfört med de andra elektroniska mikroskopteknikerna. AFM-programvaran möjliggör generering av en 3D-bildskanning genom interaktionen mellan spetsen och provytan, och spetsböjningen är korrelerad med provets höjd genom en laser och en detektor.
I statiskt läge (kontaktläge) med konstant kraft presenterar utgången två olika bilder: höjden (z-topografi) och avböjnings- eller felsignalen. Statiskt läge är ett värdefullt, enkelt bildläge, särskilt för robusta prover i luft som kan hantera de höga belastningar och vridkrafter som utövas av statiskt läge. Avböjnings- eller felläget drivs i konstant kraftläge. Topografibilden förbättras dock ytterligare genom att avböjningssignalen läggs till ytstrukturen. I detta läge kallas avböjningssignalen också felsignalen eftersom avböjningen är återkopplingsparametern; Alla funktioner eller morfologi som visas i den här kanalen beror på "felet" i återkopplingsslingan eller snarare på grund av återkopplingsslingan som krävs för att upprätthålla ett konstant avböjningsbörvärde.
AFM: s unika design gör den kompakt - tillräckligt liten för att passa på en bordsskiva - samtidigt som den har tillräckligt hög upplösning för att lösa atomsteg. AFM-utrustningen har en lägre kostnad än utrustningen för andra elektroniska mikroskop, och underhållskostnaderna är minimala. Mikroskopet kräver inte ett laboratorium med speciella förhållanden som ett renrum eller ett isolerat utrymme; Det behöver bara ett vibrationsfritt skrivbord. För AFM behöver proverna inte genomgå en detaljerad beredning som för andra tekniker (guldöverdrag, bantning); Endast ett torrt prov behöver fästas på provhållaren.
Vi använder AFM-kontaktläge för att observera bakteriella morfologier och effekterna av NP. Populationen och cellulär morfologi hos bakterier fixerade på ett stöd kan observeras, liksom den cellulära skada som produceras av nanopartiklar på bakteriearten. Bilderna som erhållits med AFM-kontaktläge bekräftar att det är ett kraftfullt verktyg och inte begränsas av reagens och komplicerade procedurer, vilket gör det till en enkel, snabb och ekonomisk metod för bakteriell karakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriell isolering och identifiering
- Isolering av en endofytisk stam från vitlökslamperistemer:
- Placera 2 mm fragment av meristems från tidigare skalade, desinficerade och skurna vitlökslökar på tryptikassojaagar (TSA) som ett rikt tillväxtmedium och inkubera vid 25 °C i 1 dag.
- Baserat på de morfologiska skillnaderna mellan bakteriekolonierna - form, storlek, färg, kant, överfört ljus, reflekterat ljus, textur, konsistens och pigmentproduktion - beskriva de olika observerade morfotyperna och rena genom att korsstrecka en representativ koloni av varje morfotyp.
- Bevara alla renade bakteriestammar i 30% glycerol vid -80 ° C.
- Identifiera en slumpmässigt vald stam (9AP) genom sekvensering av 16S rDNA. Extrahera DNA enligt metoden för Hoffman och Winston8.
- Förstärk 16S rRNA genom polymeraskedjereaktion (PCR) med 100 ng DNA, 1x polymerasbuffert, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP, 10 pmol vardera av 27F / 1492r universella oligonukleotider och 1 U DNA-polymeras9. Använd följande termiska cykler: 95 °C i 5 minuter för den första denaturaliseringen; följt av 35 cykler om 1 min vid 94 °C som denaturalisationstemperatur, 1 min vid 56 °C som hybridiseringstemperatur och 1 min vid 72 °C som förlängningstemperatur. och därefter 10 min vid 72 °C som en sista förlängning.
- Kapillärsekvens PCR-produkten med användning av samma oligonukleotider; Använd dideoxiterminalmetoden med matrisinstallationssatsen för kapillärsekvensering10 och utför elektrofores i ett automatiserat multikapillärsystem11.
- Redigera sekvenserna manuellt, jämför sekvensen med GenBank-biblioteket med hjälp av en BLAST-sökning och identifiera preliminärt stammen med guldstandarden på minst 98,7% identitet med närmaste art12,13.
OBS: Stammen 9AP identifierades som tillhörande arten av Pseudomonas hunanensis, med en identitet på 99,86% med sekvensen för stammen P. hunanensis LV (JX545210).
2. Beredning av bakterieprov för morfologisk observation med AFM
- Under sterila förhållanden, placera en droppe av bakteriesuspensionen (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) på en glasskiva.
- Fixa proverna på bilden genom torr uppvärmning. För glaset försiktigt över en låga flera gånger tills provet är torrt.
OBS: Fixering av prover är en rutinmässig teknik inom mikrobiologi för att observera fasta prokaryota organismer och för att simulera deras struktur som levande celler så nära som möjligt. - Placera de fasta proverna i en petriskål och ta dem till AFM-utrustningen för observation.
OBS: Eftersom proverna kan ändras av väderförhållandena över tid, avsätt en maximal tid på 24 timmar för analys i AFM-utrustningen. Förvara proverna fria från damm.
3. Antibakteriell effekt av MgO nanopartiklar mot bakterier
OBS: Syntesen och karakteriseringen av MgO NPs har publicerats tidigare14. I detta arbete uppskattades nanomaterialens antibakteriella aktivitet baserat på manualen från Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) med hjälp av makroutspädnings- och mikroutspädningsmetoder för hämning15,16.
- Uppskattning av minsta hämmande aktivitet (MIC) och baktericider (CMB)
- Förväxt av stammarna
- Inokulera en lämplig mängd Escherichia coli eller Staphylococcus aureus i näringsrik buljong för att erhålla en slutlig koncentration på 1 × 108 CFU/ml.
- Inkubera suspensionen vid 37 °C (± 2 °C) i 18–24 timmar.
- Posttillväxt av acklimatiserade stammar
- Fördjupa en steril bakteriologisk slinga i suspensionen, vidrör rörets botten.
- Utför ränder med öglan på eosin och metylenblå agar och näringsagar.
- Inkubera agarplattorna vid 37 °C (± 2 °C) i 24 timmar.
- Urval av kolonier för beredning av det standardiserade inokulatet
- Ta tre till fem kolonier med samma morfologiska typ genom att röra toppen av kolonin i petriskålen med en bakteriologisk slinga.
- Överför och fördjupa urvalet i 3-5 ml Müller-Hinton buljong.
- Inkubera vid 37 °C (± 2 °C) för att uppnå en grumlighet på 1 × 10 8 CFU/ml eller 2 × 108 CFU/ml.
OBS: I detta arbete användes McFarlands grumlighetsstandarder som referens för bakteriologiska suspensioner; specifikt motsvarar 0,5-standarden ungefär en homogen E. coli-suspension av 1,5 × 108 celler / ml. En UV-Vis-spektrofotometer användes för att mäta grumligheten. - Ta 1 ml och tillsätt den till 9 ml steril buljong. Ta 200 μL av denna spädning och tillsätt den till 19,8 ml steril buljong för att erhålla en slutlig koncentration på 5 × 105 CFU/ml.
- Erforderliga koncentrationer av MgO nanopartiklar
- Använd en ultraljudsapparat för beredning av lösningarna.
- Suspendera nanomaterialet i sterilt vatten i två gånger den koncentration som krävs för att erhålla seriella lösningar.
- Tillsätt dessa suspensioner till sterila rör som innehåller Müller-Hinton buljong för att uppnå det nya koncentrationsområdet som krävs för experimentet.
OBS: Följande MgO NP-koncentrationer applicerades för mikroutspädning: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1,000 ppm, 2,000 ppm, 3,000 ppm, 4,000 ppm och 8,000 ppm.
- Beredning av mikroutspädning15
- Förbered en ny och steril 96-brunns mikrotiterplatta (mikroplatta). Etikettkolumn nr 12 på mikroplattan som en sterilitetskolonn; etikettkolumn nr 11 som en tillväxtkontrollkolumn.
- Tillsätt 120 μL av nanopartikelsuspensionerna med de olika koncentrationerna till kolumnerna nr 1-10.
- Inokulera 120 μL bakterier (5 × 105 CFU/ml) i brunnarna i kolumnerna nr 1–10.
OBS: För denna studie kontrollerades rad G och rad H med ceftriaxon vid koncentrationer som föreslagits av CLSI-standarder: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm och 0,03 ppm. - Inkubera mikroplattan med 96 brunnar i 24 timmar vid 37 °C (35 °C ± 2 °C). Slutligen analysera brunnarna.
- Förväxt av stammarna
- Observation av MgO nanopartikelinducerade morfostrukturella förändringar i bakteriestammarna av AFM
- Ta 250 μl från brunnarna i mikroutspädningstesterna, blanda med 750 μl sterilt vatten och centrifugera vid 2 000 × g från 2 min till 5 min vid 5 °C.
- Tvätta fällningarna tre gånger med 1 ml sterilt vatten varje gång, och tillsätt 500 μL vatten till dem i slutet av tvättarna.
- För att få AFM-bilderna, ta 10-20 μL av den slutliga suspensionen för varje startbrunn, utför ett utstryk på ett glas som tidigare rengjorts med ultraljud (30 min) och torka vid rumstemperatur i 1 h.
4. AFM-mätningar
OBS: Här monterades atomkraftmikroskopet i kontaktläge på en antivibrationsarbetsstation som möjliggjorde isolering av mikroskopet från alla mekaniska vibrationskällor och höll systemet jämnt. Elektriska störningar minskar med linjefilter och överspänningsskydd. AFM som används här justerar automatiskt laserstrålen till fotodetektorn.
- Slå på datorn och AFM och välj sedan kontaktläge, contAI-G-proberna och alternativen Auto Slope i programvaruverktygen. Standardvärdena för Z-styrenheten är börvärde = 20 nM, P-förstärkning = 10 000, I-förstärkning = 1 000, D-förstärkning = 0 och spetsspänning = 0 mV.
- Placera provexemplaren i AFM-kontaktläge med ett 70 μm skanningsområdeshuvud. Vi använde ContAI-G kiselkonsoler med en fjäderkonstant på 0,13 N/m.
- Använd en kameraenhet monterad på två linser integrerade i skanningshuvudet för att få en snabb bild av ytan på området under sonden.
- Utför manuellt en förskjutning i XY-planet för att välja önskat område. Sonden är gjord för att elektroniskt närma sig ytprovet tills kontaktförhållandena uppnås. Justera skannerns XY-mätplan och provytan elektroniskt genom att minska lutningarna i XY-riktningarna.
- Använd programvarans standardparametrar: 1 rad per sekund vid 256 poäng per rad.
- Utför först ett fullständigt skanningsområde på ett område på 70 μm x 70 μm; Välj sedan ett mindre område med zoomverktyget. AFM optimerar diagramområdet i Z automatiskt.
OBS: Genom att minska linjerna per sekund ökar den totala skanningstiden, skanningens kvalitet definieras mer och en del brus från mätningen rensas också. - För att välja ett nytt område från provet, dra tillbaka utskjutaren elektroniskt och flytta provet längs XY-planet. Utför en ny genomsökning med hjälp av proceduren som beskrivs i steg 4.5 och steg 4.6.
OBS: De erhållna skanningarna visas i en enfärgad stapelskala, där de ljusa färgerna är associerade med högre höjder och de mörka färgerna är associerade med djupare höjder. AFM-programvaran genererar en 3D-vy av skanningen som gör det möjligt att uppskatta detaljerna på den uppmätta ytan. - Utför databehandlingen med hjälp av rad-för-rad-nivelleringen i menyn Verktyg i bilden i filtervalet, vilket är den mest använda och enklaste nivelleringsmetoden.
OBS: Denna nivelleringsmetod tar varje horisontell eller vertikal linje som produceras i AFM-bilden och anpassar den till en polynomekvation. - Optimera maximal och minsta höjd i färgfältet till höger för att få bästa bildupplösning.
- Utför bildanalysen med hjälp av menyn Analys i verktygsfältet. Bestäm höjder och avstånd genom att välja start- och slutpunkter när önskat verktyg har valts.
Användare måste prova de olika filtren på menyn Verktyg för att undvika artefakter med spetsbilder på grund av den förenkling som används i utjämningsprocessen. Bildartefakter visas som strecklinjer och visas i några av AFM-bilderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bilder av morfologin och storleken på stammarna S. aureus och P. hunanensis , liksom befolkningsorganisationen för båda stammarna, togs med atomkraftmikroskopi i kontaktläge. S. aureus-bilderna visade att dess befolkning fördelades av zoner med aggregat av kocker (figur 1A). Med en ökning i skala var det en större uppskattning av kockernas befolkningsfördelning och morfologi (figur 1B). Mikroskopirapporterna visade att en pseudo-halvsfärisk struktur var närvarande i intilliggande celler av S. aureus, men att bakterierna i allmänhet presenterade en sfärisk morfologi i form av en coccus efter celldelning, som tidigare visats i AFM-bilderna. Dessutom möjliggjorde AFM-kontaktlägesbilderna bestämning av kockernas storlek, vilket visade en genomsnittlig bredd på 1,25 μm. De värden som erhålls från mätningen av 20 celler visas i figur 2.
I fallet med P. hunanensis observerades en homogen fördelning på hela ytan av glasstödet och bildade ett bakteriellt monolager som vidhäftade stödet (figur 3A), som rapporterats av Zuttion et al., där författarna immobiliserade P. aureginosa på ett fast stöd och visade samma beteende. Pseudomonas hunanensis-bakterier observerades vara stavformade, med en längd av 1,9 μm (L) och en bredd av 0,9 μm (W) (figur 3B,C); Dessa data ligger inom de rapporterade värdena för P. fluorescens på 1,5-2,0 μm (L) och 0,6-0,9 μm (W)17,18,19.
För att visualisera de morfostrukturella förändringarna på grund av interaktionen mellan MgO NP utsattes bakteriestammarna för AFM-analys efter behandling (mikroutspädning). Tre grupper visas i figur 4 och figur 5: figur 4A–C och figur 5A–C är kontrollerna. Bilderna i figur 4D-F och figur 5D-F har erhållits från resultaten av mikroutspädningen vid övervaknings- och informationsminnet. Bilderna av figur 4G-I och figur 5G-I erhölls i en högre koncentration än mikrofonen.
Bilderna av den övre gruppen i figur 4A-C visar en coccus-typ cell av Staphylococcus aureus med en slät yta och homogena konturer, som växte i en lämplig miljö i Müeller-Hinton buljong i 24 timmar enligt mikroutspädningstekniken. Medeldiametern var 1 μm ± 0,15 μm. Denna diameter försvann praktiskt taget efter NP-behandling, som visas i figur 4D-F, eftersom försämringen av cellstrukturen var mycket allvarlig. Enligt tvärsnittet var medelhöjden för kontrollen 200 nm ± 50 nm; Höjden på de behandlade cellerna reducerades med 40% (120 nm ± 5 nm) i förhållande till kontrollerna. Bilderna visar tydligt förändringar i ytan, såsom bildandet av vesiklar, efter exponering för MgO NP i partiklarnas CMI; Dessutom, genom att fördubbla koncentrationerna, påverkades cellstrukturernas interna status och cytosoliskt material frigjordes, vilket visas i bilderna i figur4G-I 20,21.
Dessa förändringar identifierades också i E. coli-celler, som visas i figur 5, med tillstånd som liknar S. aureus. Kontrollerna av denna bakterie visade släta ytor och framhävde dess mycket homogena stavliknande form (bacillus) utan någon uppenbar förändring. De tredimensionella bilderna visar de högsta topografiska regionerna associerade med mikroorganismen i vitt. Den genomsnittliga höjden på kontrollen E. coli var 160 nm ± 50 nm, och enligt tvärsnittsbilderna minskade medelhöjden till 76 nm ± 10 nm för celler som exponerades i 24 timmar till en koncentration av MgO nanopartiklar på 500 ppm (MIC). Strukturen försvann helt i en koncentration av 1 000 ppm, och endast bakteriernas silhuetter kunde särskiljas. Vid analys av bilderna för båda koncentrationerna observerades att med avseende på kontrollerna förändrades cellmorfologin hos de behandlade cellerna signifikant, med en förlängning av 2,0 μm ± 0,5 μm (figur 5A-C) till 3,0 μm ± 0,3 μm, som visas i bilderna i figur 5D-I. Denna ökning var tydlig när den cellulära strukturen förlorade intern homeostas och orsakade strukturell kollaps20,22. Bilderna av bakterier som exponerats för MgO NP visade tydligt ytförändringar såsom åsbildning eller korrugeringar som bildar vesikulära störningar vid båda MIC: erna och vid fördubbling av koncentrationerna20,22.
Figur 1: Kontaktläge för atomkraftmikroskopi för Staphylococcus aureus. Denna figur visar topografierna tagna från S. aureus i olika skalor: (A) 70 μm och (B) 5,0 μm. Kartläggningsområdena valdes för att erhålla S. aureus-topografin ; bild B visar tydligt S. aureus cocci. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Atomkraftsmikroskopi, kontaktläge, topografier och histogram av Staphylococcus aureus. Bilden visar (A) topografi och (B) histogram av diametrarna hos S. aureus-bakterier fixerade på ett glasstöd med hjälp av värmefixeringsproceduren. Celldiametern mättes med AFM-programvara; n = 20. Bilden är en representation av mätningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kontaktläge för atomkraftmikroskopi för Pseudomonas hunanensis 1AP-CY. Denna figur visar topografierna tagna från P. hunanensis 1AP-CY i olika skalor: (A) 70 μm, (B) 20 μm och (C) 5,0 μm. Bilderna i olika skalor visar fördelningen av cellpopulationen på bilden. För att analysera cellmorfologin fokuseras ett område med lägre befolkningstäthet, som visas i bild B, som visar stavformen hos P. hunanensis (avböjningssignalen visas för att förbättra topografibilden). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. AFM-kontaktlägesbilder erhållna för obehandlade S. aureus (överst) och S. aureus exponerade för 250 ppm och 500 ppm MgO nanopartiklar (mitten och botten) i 24 timmar. (A,D,G) Topografiska bilder; (B,E,H) tredimensionella bilder; (C,F,I) tvärsnittsbilder. Strukturella förändringar i bakterierna observerades vid användning av den minsta hämmande koncentrationen av MgO (250 ppm) och en högre koncentration (500 ppm). Avböjningssignalen visas för att förbättra topografibilden. Figur 4A, D, G är från Muñiz Diaz et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: AFM-kontaktlägesbilder erhållna för obehandlade E. coli (överst) och E. coli som exponerats för 500 ppm och 1 000 ppm MgO-nanopartiklar (mitten och botten) i 24 timmar. (A, D, G) topografiska bilder; (B,E,H) tredimensionella bilder; (C,F,I) tvärsnittsbilder. Strukturella förändringar hos bakterierna observerades vid användning av den minsta hämmande koncentrationen av MgO (500 ppm) och en högre koncentration (1 000 ppm). Figur 5A, D, G är från Muñiz Diaz et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroskopi är en teknik som vanligtvis används i biologiska laboratorier som möjliggör undersökning av struktur, storlek, morfologi och cellulärt arrangemang av biologiska prover. För att förbättra denna teknik kan flera typer av mikroskop användas som skiljer sig från varandra när det gäller deras optiska eller elektroniska egenskaper, som bestämmer instrumentets upplösningseffekt.
I vetenskaplig forskning krävs användning av mikroskopi för karakterisering av bakterieceller; till exempel har mikroskopi visat att NaCl påverkar värmebeständigheten och cellmorfologin hos E. coli-stammar, Schisandra chinensis-extrakt visar antibakteriella effekter mot S. aureus, S. aureus utvecklar termotolerans efter subletal värmechock och E. coli biomineraliserar platina 23,24,25,26,27 . Således har fördelarna med AFM möjliggjort sin expansion till forskningsområdena miljö och biologi.
Atomkraftmikroskopet är ett instrument som används i kontaktläge för att analysera bakterier in situ och i kontaktfritt läge för att bestämma topografin hos makro- och nanoskopiska material. Fördelen med AFM jämfört med andra tekniker är att det krävs färre prover för att få topografiska bilder; Det anses också vara en icke-destruktiv teknik, och det skadar inte eller äventyrar strukturen hos den analyserade bilden. Även om vi använde värmefixering i detta protokoll ändrades inte bakteriecellens morfologi. Det är viktigt att nämna att denna teknik ofta används i mikrobiologilaboratoriet för att studera bakteriella morfologier. Till skillnad från i växt- och djurvävnadsprover, producerar värmefixeringstekniken förändringar i proteiner och lipider som manifesteras i vävnadsförsämring; I bakterier orsakar tekniken en liten krympning av cellen som inte stör observationen av cellform och identifiering.
Med AFM är provberedningen enkel och kräver inga kemiska produkter, som i fallet med elektronmikroskopi, där det är viktigt att provet som ska analyseras är ledande, eftersom bilden produceras genom interaktionen mellan elektronerna som emitteras av utrustningen och provet. Om provet inte är ledande måste det metalliseras med ett ledande element som guld med hjälp av den fysiska ångavsättningstekniken. Dessutom når upplösningen av elektronmikroskopi upp till 0,4 nm, beroende på lins och modell, medan AFM i kontaktläge kan nå mikrometer, nanometer eller till och med pikometerupplösning, vilket gör den konkurrenskraftig med elektronmikroskopi22. En annan fördel med AFM jämfört med elektronmikroskopi är att det inte kräver höga vakuumförhållanden för provbearbetning20,21. Andra fördelar med AFM jämfört med vanliga tekniker är den låga kostnaden och korta bildupptagningstiden.
När det gäller tekniken för att fixera bakterieprovet på en glasplatta är det viktigt att nämna att värmefixering är en teknik som vanligtvis används i mikrobiologiska laboratorier. Denna teknik används så att bakterieprover kan identifieras genom enkel eller differentiell färgning. Samtidigt kan man se formen på bakterierna, vanligen kocker eller stavar. En nackdel med värmefixeringstekniken är minskningen av bakteriens storlek, men denna teknik äventyrar inte bakteriens form.
Efter fixering måste försiktighet vidtas för att undvika åldrandet av provet, vilket kan manifesteras som en signifikant minskning av cellstorleken; Därför är det lämpligt att analysera provet inom 24 timmar efter fixering. Försiktighet bör också iakttas för att säkerställa att provet inte utsätts för damm. Proverna bör därför förvaras i en sluten behållare (t.ex. en petriskål). Dessa villkor är kritiska eftersom de kan ändra de erhållna AFM-bilderna.
Det är uppenbart att en minskning av bakteriernas storlek kan påverka visst forskningsarbete, liksom att andra sätt att fästa bakterierna till ett stöd kan krävas. Till exempel har S. aureus-biofilmer odlade i BM-buljong på 34 mm plattor fixerats med glyceraldehyd. Vidare har S. aureus immobiliserats med V-formade konsoler behandlade med poly-l-lysin, medan för C. albicans har hyfer fixerats på glasskivor belagda med positivt laddad poly-l-lysin för att analysera utbytet av adsorberade serumproteiner under vidhäftningen av båda till en abiotisk yta28,29.
I detta arbete förändrade värmefixering av proverna inte formen eller aggregaten som bildades av bakterierna, och värmefixeringen gjorde det möjligt att visualisera effekten av nanopartiklarna. Därför kan AFM-topografierna visa formen på de isolerade kockerna eller aggregaten av S. aureus och stavarna av P. hunanensis (figur 1 och figur 3). Dessutom fann vi också att S. aureus och E. coli visade skador i sina strukturer på grund av effekten av MgO-nanopartiklarna, medan kontrollproverna (utan nanopartiklar) inte visade någon förändring i deras morfologi (figur 4 och figur 5).
Detta arbete visar att användningen av AFM-kontaktläget är ett livskraftigt alternativ för att karakterisera yttopologin och defekterna hos biologiska prover, vilket har visats med S. aureus, P. hunanensis och E. coli. Dessutom är värmefixeringstekniken inte en avgörande faktor som förändrar cellytan och förhindrar analys. Blygsamt kan vi föreslå att värmefixering kan vara en fördel vid användning av AFM. Prover bearbetas mindre och användning av kemiska reagenser undviks. Därför är metoden en enkel och ekonomisk teknik. Det är värt att nämna att detta kan förändras beroende på den specifika analysen som ska utföras, vilket visas för studien av biofilmer och bakteriell vidhäftning28,29. Som en möjlig förlängning av detta arbete kan kontaktläge AFM användas för att analysera effekten av NP på andra medicinskt viktiga bakterier eller i forskning där cellskador ska observeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Ramiro Muniz-Diaz tackar CONACyT för stipendiet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
References
- Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
- Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367 (2015).
- Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology. Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).
- Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C.
- Smith, W. P., et al. Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).
- Volke, D. C., Nikel, P. I. Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories. Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111 (2018).
- Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology. Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).
- Hoffman, C. S., Winston, F. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis. ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).
- Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure. Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stackebrandt, E., Ebers, J. Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards. Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).
- Muñiz Diaz, R., et al. Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria. Nanomaterials. 11 (2), 410 (2021).
- Andrews, J. M.
- Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods. 42 (4), 321-324 (2007).
- Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).
- Yamada, S., et al. autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).
- Zuttion, F., et al. The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy. Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).
- Kahli, H., et al. Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579 (2022).
- Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations. World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society Interface. 15, 140 (2018).
- Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents. Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).
- Lee, H. -E., et al. NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains. Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).
- Song, L. Y., et al. Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food. Journal of Food Safety. 38 (5), e12503 (2018).
- Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock. Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).
- Shar, S. S., et al. Biomineralization of platinum by Escherichia coli. Metals. 9 (4), 407 (2019).
- Baidamshina, D., et al. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Scientific Reports. 7, 46068 (2017).
- Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).
