Neuartige In-vivo-Mikro-Computertomographie-Bildgebungsverfahren zur Beurteilung des Fortschreitens der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung

Summary

Unter Verwendung eines diätinduzierten Mausmodells der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) beschreiben wir den Einsatz neuartiger in vivo Mikro-Computertomographie-Bildgebungsverfahren als nicht-invasive Methode zur Beurteilung der Progressionsstadien der NAFLD, wobei der Schwerpunkt hauptsächlich auf dem hepatischen Gefäßnetzwerk liegt, da es maßgeblich an der NAFLD-bedingten Leberdysregulation beteiligt ist.

Abstract

Die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist ein wachsendes globales Gesundheitsproblem, und die Auswirkungen der NAFLD werden durch den derzeitigen Mangel an wirksamen Behandlungen noch verstärkt. Erhebliche limitierende Faktoren, die die rechtzeitige und genaue Diagnose (einschließlich Grading) und Überwachung von NAFLD sowie die Entwicklung potenzieller Therapien behindern, sind die derzeitigen Unzulänglichkeiten bei der Charakterisierung der Struktur der hepatischen Mikroumgebung und der Bewertung des Krankheitsstadiums in raumzeitlicher und nicht-invasiver Weise. Unter Verwendung eines diätinduzierten NAFLD-Mausmodells untersuchten wir den Einsatz von in vivo Mikro-Computertomographie (CT)-Bildgebungsverfahren als nicht-invasive Methode zur Beurteilung der Progressionsstadien der NAFLD, wobei wir uns hauptsächlich auf das hepatische Gefäßnetzwerk konzentrierten, da es maßgeblich an der NAFLD-bedingten Leberdysregulation beteiligt ist. Diese bildgebende Methodik ermöglicht eine longitudinale Analyse der Lebersteatose und der funktionellen Gewebeaufnahme sowie die Beurteilung des relativen Blutvolumens, des Pfortaderdurchmessers und der Dichte des Gefäßnetzwerks. Das Verständnis der Anpassungen des hepatischen Gefäßnetzwerks während der NAFLD-Progression und die Korrelation mit anderen Methoden zur Charakterisierung des Krankheitsverlaufs (Steatose, Entzündung, Fibrose) mit der vorgeschlagenen Methode kann den Weg für die Etablierung neuer, effizienterer und reproduzierbarer Ansätze für die NAFLD-Forschung an Mäusen ebnen. Es wird auch erwartet, dass dieses Protokoll den Wert präklinischer Tiermodelle für die Untersuchung der Entwicklung neuartiger Therapien gegen das Fortschreiten der Krankheit erhöht.

Introduction

Die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist eine Stoffwechselerkrankung, von der etwa 25 % der Bevölkerung und >80 % der krankhaft adipösen Menschen betroffen sind¹. Schätzungsweise ein Drittel dieser Personen entwickelt eine nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH), die durch Lebersteatose, Entzündung und Fibrose gekennzeichnet ist². NASH ist ein Krankheitsstadium mit einem signifikant höheren Risiko für die Entwicklung von Zirrhose und hepatozellulärem Karzinom (HCC)^3,4. Aus diesem Grund ist NASH derzeit die zweithäufigste Ursache für Lebertransplantationen und wird voraussichtlich bald auch der wichtigste Prädiktor für Lebertransplantationen sein ^5,6,7. Trotz ihrer Prävalenz und ihres Schweregrads gibt es keine krankheitsspezifische Therapie für NAFLD, und die bestehenden Behandlungen zielen nur darauf ab, krankheitsassoziierte Pathologien wie Insulinresistenz und Hyperlipidämie zu bekämpfen ^5,6.

In den letzten Jahren haben die pathophysiologische Rolle und Anpassungen des Endothels und allgemein des vaskulären Netzwerks von Stoffwechselgeweben, wie dem Fettgewebe und der Leber, in der Forschung zunehmend an Bedeutung gewonnen, insbesondere bei Adipositas und metabolischer Dysregulation ^7,8. Das Endothel ist eine zelluläre Monoschicht, die das Gefäßnetzwerk intern auskleidet und als funktionelle und strukturelle Barriere fungiert. Es trägt auch zu verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen bei, wie z. B. Thrombosen, Metabolitentransport, Entzündungen und Angiogenese ^9,10. Im Falle der Leber zeichnet sich das Gefäßnetzwerk unter anderem durch das Vorhandensein hochspezialisierter Zellen aus, die als sinusförmige Endothelzellen der Leber (LSECs) bezeichnet werden. Diesen Zellen fehlt eine Basalmembran und sie haben mehrere Fenestrae, was den Transfer von Substraten zwischen Blut und Leberparenchym erleichtert. Aufgrund ihrer charakteristischen anatomischen Lage und Eigenschaften spielen LSECs wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei den pathophysiologischen Prozessen der Leber, einschließlich der Entwicklung von Leberentzündungen und Fibrose während NAFLD/NASH. Tatsächlich tragen die pathologischen, molekularen und zellulären Anpassungen, die LSECs im Verlauf der NAFLD durchlaufen, zum Fortschreiten der Krankheit bei¹¹. Insbesondere die LSEC-abhängige hepatische Angiogenese, die während der NAFLD stattfindet, ist signifikant mit der Entwicklung von Entzündungen und dem Fortschreiten der Krankheit zu NASH oder sogar HCC¹² verbunden. Darüber hinaus ist die Adipositas-bedingte frühe NAFLD durch die Entwicklung einer Insulinresistenz in LSECs gekennzeichnet, die der Entwicklung einer Leberentzündung oder anderer fortgeschrittener NAFLD-Anzeichen vorausgeht¹³.

Darüber hinaus haben sich LSECs in jüngster Zeit als zentrale Regulatoren des Leberblutflusses und der Anpassungen des Gefäßnetzwerks während Lebererkrankungen verschiedener Ätiologien herausgestellt^14,15. In der Tat ist eine chronische Lebererkrankung durch eine ausgeprägte intrahepatische Vasokonstriktion und eine erhöhte Resistenz gegen den Blutfluss gekennzeichnet, die zur Entwicklung einer portalen Hypertonie beitragen¹⁶. Im Falle der NAFLD tragen mehrere LSEC-bezogene Mechanismen zu diesem Phänomen bei. Zum Beispiel ist eine LSEC-spezifische Insulinresistenz, wie oben erwähnt, mit einer reduzierten insulinabhängigen Vasodilatation des Lebergefäßsystems verbunden¹³. Außerdem wird das Lebergefäßsystem im Laufe der Erkrankung empfindlicher gegenüber Vasokonstriktoren, was weiter zu einer Beeinträchtigung des Leberblutflusses beiträgt und zur Entstehung von Scherstress führt, die beide zu einer Störung der sinusförmigen Mikrozirkulation führen¹⁷. Diese Tatsachen deuten darauf hin, dass das Gefäßsystem ein wichtiges Ziel bei Lebererkrankungen ist. Limitierende Faktoren, die die rechtzeitige Diagnose und Überwachung von NAFLD/NASH sowie die Entwicklung potenzieller Therapien behindern, sind jedoch die Unzulänglichkeiten bei der konsistenten Charakterisierung der hepatischen Mikroumgebung und der (mikro)vaskulären Struktur sowie der Bewertung des Krankheitsstadiums in raumzeitlicher und nicht-invasiver Weise.

Die Mikro-Computertomographie (CT) ist derzeit der Goldstandard unter den nicht-invasiven Bildgebungsverfahren, um anatomische Informationen innerhalb eines lebenden Organismus genau darzustellen. Mikro-CT und MRT stellen zwei komplementäre Bildgebungsverfahren dar, die ein breites Spektrum von Pathologien abdecken können und eine außergewöhnliche Auflösung und Detailgenauigkeit in den abgebildeten Strukturen und Geweben bieten. Insbesondere die Mikro-CT ist ein sehr schnelles und genaues Instrument, das häufig zur Untersuchung von Pathologien wie Knochenerkrankungen und damit verbundenen Knochenoberflächenveränderungen¹⁸, zur Beurteilung des Fortschreitens der Lungenfibrose im Laufe der Zeit¹⁹, zur Diagnose von Lungenkrebs und seinem Staging²⁰ oder sogar zur Untersuchung von Zahnpathologien²¹ verwendet wird, ohne dass eine spezielle Präparation (oder Zerstörung) der abgebildeten Proben erforderlich ist.

Die bildgebende Technologie der Mikro-CT basiert auf den unterschiedlichen Dämpfungseigenschaften verschiedener Organe in Bezug auf die Wechselwirkung von Röntgenstrahlen mit Materie. Organe mit hohen Röntgenabschwächungsunterschieden werden in CT-Bildern kontrastreich dargestellt (d.h. die Lunge erscheint dunkel und die Knochen hell). Organe, die sehr ähnliche Dämpfungseigenschaften aufweisen (unterschiedliche Weichteile), sind auf CT-Bildern schwer zu unterscheiden²². Um dieser Einschränkung zu begegnen, wurden spezielle Kontrastmittel auf Basis von Jod, Gold und Wismut für den In-vivo-Einsatz ausgiebig untersucht. Diese Mittel verändern die Dämpfungseigenschaften der Gewebe, in denen sie sich ansammeln, werden langsam aus dem Kreislauf ausgeschieden und ermöglichen die gleichmäßige und stabile Trübung des gesamten Gefäßsystems oder ausgewählter Gewebe²³.

In der Humandiagnostik werden zur Bestimmung des Leberfettgehalts bereits CT-Bildgebung und vergleichbare Techniken, wie z.B. die MRT-abgeleitete Protonendichte-Fettfraktion, eingesetzt^24,25. Im Zusammenhang mit der NAFLD ist ein hoher Weichteilkontrast unerlässlich, um pathologische Läsionen oder kleine Gefäße genau zu unterscheiden. Zu diesem Zweck werden Kontrastmittel eingesetzt, die einen verbesserten Kontrast der Lebergewebeeigenschaften bieten. Solche Werkzeuge und Materialien ermöglichen die Untersuchung mehrerer Lebermerkmale und möglicher pathologischer Ausprägungen, wie z. B. die Architektur und Dichte des vaskulären Netzwerks, die Lipidablagerung/Steatose und die funktionelle Gewebeaufnahme/den Lipidtransfer (Chylomikron) in der Leber. Zusätzlich können auch das relative Blutvolumen der Leber und der Durchmesser der Pfortader beurteilt werden. In sehr kurzer Scanzeit liefern all diese Parameter unterschiedliche und komplementäre Informationen über die Beurteilung und den Verlauf der NAFLD, die zur Entwicklung einer nicht-invasiven und detaillierten Diagnose verwendet werden können.

In diesem Artikel stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Einsatz neuartiger In-vivo-Mikro-CT-Bildgebungstechniken als nicht-invasive Methode zur Beurteilung der Progressionsstadien der NAFLD zur Verfügung. Mit diesem Protokoll kann die longitudinale Analyse der Lebersteatose und der funktionellen Gewebeaufnahme sowie die Bewertung des relativen Blutvolumens, des Pfortaderdurchmessers und der Dichte des Gefäßnetzwerks durchgeführt und in Mausmodellen für Lebererkrankungen angewendet werden.

Protocol

Alle Verfahren wurden von den Mitarbeitern von BIOEMTECH in Übereinstimmung mit den europäischen und nationalen Tierschutzbestimmungen durchgeführt und von den nationalen Behörden genehmigt (Lizenznummer EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Alle Experimente wurden unter Einhaltung der ARRIVE-Richtlinien26 konzipiert und berichtet. Die Mäuse wurden vom Hellenic Pasteur Institute in Athen, Griechenland, gekauft. HINWEIS: Die Tiere wurden in einzeln belüfteten Käfige…

Representative Results

In dieser repräsentativen Studie zeigte die Mikro-CT-Bildgebung ohne Kontrastmittel einen höheren Anteil an Leberfett bei Mäusen mit NAFLD im Vergleich zu den Kontrollen (Tabelle 2), was die Pathologie bestätigt. Unter Verwendung des ExiTron-Kontrastmittels und der oben beschriebenen Analyse der Architektur und Dichte des hepatischen Gefäßnetzwerks wurde festgestellt, dass die Gesamtvolumendichte des hepatischen Gefäßnetzwerks bei Mäusen mit NAFLD im Vergleich zu gesunden Kontrollen höher war (…

Discussion

Die derzeit empfohlene Methode für die NAFLD-Diagnose und das Staging beim Menschen ist die Leberbiopsie, die das Risiko von Blutungskomplexitäten sowie Ungenauigkeiten bei der Probenahme birgt⁴⁰. Im Gegenteil, in Tiermodellen wird eine solche Diagnose durch histologische postmortale Untersuchung durchgeführt, obwohl Protokolle für eine überlebensfähige Leberbiopsie jetzt verfügbar sind und empfohlen werden, wenn das Studiendesign dies zulässt⁴¹. Der Einsatz der pos…

Materials

eXIA160	Binitio Biomedical, Inc.		https://www.binitio.com/?Page=Products
High fat diet with 60% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12492
High-fructose corn syrup	Best flavors, CA	hfcs-1gallon
Lacrinorm ophthalmic ointment	Bausch & Lomb
Normal diet with 10% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12450
Viscover ExiTron nano 12000	Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-698
VivoQuant	Invicro
X-CUBE	Molecubes, Belgium		https://www.molecubes.com/systems/