Nieuwe in vivo micro-computertomografie beeldvormingstechnieken voor het beoordelen van de progressie van niet-alcoholische leververvetting

Summary

Met behulp van een dieet-geïnduceerde niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) muismodel, beschrijven we het gebruik van nieuwe in vivo micro-computertomografie beeldvormingstechnieken als een niet-invasieve methode om de progressiestadia van NAFLD te beoordelen, voornamelijk gericht op het hepatische vasculaire netwerk vanwege de significante betrokkenheid bij NAFLD-gerelateerde leverontregeling.

Abstract

Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is een groeiend wereldwijd gezondheidsprobleem en de impact van NAFLD wordt verergerd door het huidige gebrek aan effectieve behandelingen. Aanzienlijke beperkende factoren die de tijdige en nauwkeurige diagnose (inclusief grading) en monitoring van NAFLD belemmeren, evenals de ontwikkeling van potentiële therapieën, zijn de huidige tekortkomingen in de karakterisering van de hepatische micro-omgevingsstructuur en de score van het ziektestadium op een spatiotemporale en niet-invasieve manier. Met behulp van een dieet-geïnduceerd NAFLD-muismodel onderzochten we het gebruik van in vivo micro-computertomografie (CT) beeldvormingstechnieken als een niet-invasieve methode om de progressiestadia van NAFLD te beoordelen, voornamelijk gericht op het hepatische vasculaire netwerk vanwege de significante betrokkenheid bij NAFLD-gerelateerde leverontregeling. Deze beeldvormingsmethodologie maakt longitudinale analyse van leversteatose en functionele weefselopname mogelijk, evenals de evaluatie van het relatieve bloedvolume, de poortaderdiameter en de dichtheid van het vasculaire netwerk. Het begrijpen van de aanpassingen van het hepatische vasculaire netwerk tijdens NAFLD-progressie en dit correleren met andere manieren om de ziekteprogressie (steatose, ontsteking, fibrose) te karakteriseren met behulp van de voorgestelde methode, kan de weg vrijmaken voor de oprichting van nieuwe, efficiëntere en reproduceerbare benaderingen voor NAFLD-onderzoek bij muizen. Dit protocol zal naar verwachting ook de waarde van preklinische diermodellen voor het onderzoeken van de ontwikkeling van nieuwe therapieën tegen ziekteprogressie verbeteren.

Introduction

Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is een stofwisselingsziekte die ongeveer 25% van de bevolking en >80% van de morbide zwaarlijvige mensen treft¹. Naar schatting een derde van deze personen ontwikkelt zich tot niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), die wordt gekenmerkt door leversteatose, ontsteking en fibrose². NASH is een ziektestadium met een significant hoger risico op de ontwikkeling van cirrose en hepatocellulair carcinoom (HCC)^3,4. Om deze reden is NASH momenteel de tweede meest voorkomende oorzaak van levertransplantatie, en het zal naar verwachting ook binnenkort de belangrijkste voorspeller van levertransplantatie^{worden 5,6,7}. Ondanks de prevalentie en ernst is er geen ziektespecifieke therapie beschikbaar voor NAFLD en zijn de bestaande behandelingen alleen gericht op het aanpakken van ziektegerelateerde pathologieën zoals insulineresistentie en hyperlipidemie ^5,6.

In de afgelopen jaren zijn de pathofysiologische rol en aanpassingen van het endotheel en, in het algemeen, van het vasculaire netwerk van metabole weefsels, zoals het vetweefsel en de lever, belangrijker geworden in onderzoek, vooral tijdens obesitas en metabole ontregeling ^7,8. Het endotheel is een cellulaire monolaag die het vasculaire netwerk intern bekleedt en fungeert als een functionele en structurele barrière. Het draagt ook bij aan verschillende fysiologische en pathologische processen, zoals trombose, metaboliettransport, ontsteking en angiogenese ^9,10. In het geval van de lever wordt het vasculaire netwerk, naast andere kenmerken, gekenmerkt door de aanwezigheid van zeer gespecialiseerde cellen, gedefinieerd als lever sinusoïdale endotheelcellen (LSEC’s). Deze cellen missen een keldermembraan en hebben meerdere fenestrae, waardoor de overdracht van substraten tussen het bloed en leverparenchym gemakkelijker is. Vanwege hun onderscheidende anatomische locatie en kenmerken hebben LSEC’s waarschijnlijk een cruciale rol in de pathofysiologische processen van de lever, waaronder de ontwikkeling van leverontsteking en fibrose tijdens NAFLD / NASH. Inderdaad, de pathologische, moleculaire en cellulaire aanpassingen die LSEC’s ondergaan in de loop van NAFLD dragen bij aan de ziekteprogressie¹¹. In het bijzonder is de LSEC-afhankelijke leverangiogenese die plaatsvindt tijdens NAFLD significant geassocieerd met de ontwikkeling van ontsteking en de progressie van de ziekte naar NASH of zelfs HCC¹². Bovendien wordt obesitas-gerelateerde vroege NAFLD gekenmerkt door de ontwikkeling van insulineresistentie in LSEC’s, die voorafgaat aan de ontwikkeling van leverontsteking of andere geavanceerde NAFLD-tekenen¹³.

Bovendien zijn LSEC’s onlangs naar voren gekomen als centrale regulatoren van hepatische bloedstroom en vasculaire netwerkaanpassingen tijdens leverziekte van verschillende etiologieën^14,15. Inderdaad, chronische leverziekte wordt gekenmerkt door prominente intra-hepatische vasoconstrictie en verhoogde weerstand tegen de bloedstroom, die bijdragen aan de ontwikkeling van portale hypertensie¹⁶. In het geval van NAFLD dragen verschillende LSEC-gerelateerde mechanismen bij aan dit fenomeen. LSEC-specifieke insulineresistentie, zoals hierboven vermeld, is bijvoorbeeld geassocieerd met verminderde insulineafhankelijke vaatverwijding van de levervasculatuur¹³. Bovendien wordt de levervasculatuur in de loop van de ziekte gevoeliger voor vasoconstrictoren, wat verder bijdraagt aan een verslechtering van de leverbloedstroom en leidt tot het ontstaan van schuifspanning, die beide resulteren in een verstoring van de sinusoïdale microcirculatie¹⁷. Deze feiten suggereren dat de vasculatuur een belangrijk doelwit is bij leverziekte. Niettemin zijn beperkende factoren die de tijdige diagnose en monitoring van NAFLD / NASH belemmeren, evenals de ontwikkeling van potentiële therapieën, de tekortkomingen in de consistente karakterisering van de hepatische micro-omgeving en (micro)vasculaire structuur, evenals de score van het ziektestadium op een spatiotemporale en niet-invasieve manier.

Micro-computertomografie (CT) beeldvorming is momenteel de gouden standaard niet-invasieve beeldvormingsmethode voor het nauwkeurig weergeven van anatomische informatie in een levend organisme. Micro-CT en MRI vertegenwoordigen twee complementaire beeldvormingsmethoden die een breed scala aan pathologieën kunnen bestrijken en uitzonderlijke resolutie en detail bieden in de afgebeelde structuren en weefsels. Micro-CT, in het bijzonder, is een zeer snel en nauwkeurig hulpmiddel dat vaak wordt gebruikt voor het bestuderen van pathologieën zoals botziekten en bijbehorende veranderingen in het botoppervlak¹⁸, het beoordelen van de progressie van longfibrose in de loop van de tijd¹⁹, het diagnosticeren van longkanker en de stadiëring ervan²⁰, of zelfs het onderzoeken van tandheelkundige pathologieën²¹, zonder dat een speciale voorbereiding (of vernietiging) van de monsters in beeld wordt gebracht.

De beeldvormingstechnologie van micro-CT is gebaseerd op de verschillende verzwakkingseigenschappen van verschillende organen in termen van de interactie van röntgenstralen met materie. Organen met hoge röntgenverzwakkingsverschillen worden afgebeeld met een hoog contrast in CT-beelden (d.w.z. de longen lijken donker en de botten licht). Organen met zeer vergelijkbare verzwakkingseigenschappen (verschillende zachte weefsels) zijn moeilijk te onderscheiden op CT-beelden²². Om deze beperking aan te pakken, zijn gespecialiseerde contrastmiddelen op basis van jodium, goud en bismut uitgebreid onderzocht voor in vivo gebruik. Deze middelen veranderen de verzwakkingseigenschappen van de weefsels waarin ze zich ophopen, worden langzaam uit de bloedsomloop verwijderd en maken de uniforme en stabiele opacificatie van het gehele vasculaire systeem of gekozen weefsels mogelijk²³.

In de menselijke diagnostiek worden CT-beeldvorming en vergelijkbare technieken, zoals MRI-afgeleide protondichtheid vetfractie, al gebruikt voor de bepaling van het levervetgehalte^24,25. In de context van NAFLD is een hoog contrast van zacht weefsel essentieel om pathologische laesies of kleine bloedvaten nauwkeurig te onderscheiden. Voor dit doel worden contrastmiddelen gebruikt die een verbeterd contrast van de leverweefselkenmerken bieden. Dergelijke hulpmiddelen en materialen maken de studie van meerdere leverkenmerken en mogelijke pathologie-expressies mogelijk, zoals de architectuur en dichtheid van het vasculaire netwerk, lipideafzetting / steatose en functionele weefselopname / lipide (chylomicron) overdracht in de lever. Bovendien kunnen het relatieve levervolume en de poortaderdiameter ook worden geëvalueerd. In een zeer korte scantijd bieden al deze parameters verschillende en complementaire informatie over de evaluatie en progressie van NAFLD, die kan worden gebruikt om een niet-invasieve en gedetailleerde diagnose te ontwikkelen.

In dit artikel bieden we een stapsgewijs protocol voor het gebruik van nieuwe in vivo micro-CT-beeldvormingstechnieken als een niet-invasieve methode om de progressiestadia van NAFLD te beoordelen. Met behulp van dit protocol kan de longitudinale analyse van leversteatose en functionele weefselopname, evenals de evaluatie van het relatieve bloedvolume, de poortaderdiameter en de dichtheid van het vasculaire netwerk, worden uitgevoerd en toegepast in muismodellen van leverziekte.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd door het personeel van BIOEMTECH in overeenstemming met de Europese en nationale welzijnsvoorschriften en werden goedgekeurd door de nationale autoriteiten (licentienummer EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Alle experimenten werden ontworpen en gerapporteerd met inachtneming van ARRIVE-richtlijnen26. De muizen werden gekocht bij het Hellenic Pasteur Institute, Athene, Griekenland. OPMERKING: De dieren werden gehuisvest in individueel g…

Representative Results

In deze representatieve studie wees micro-CT-beeldvorming zonder enig contrastmiddel op een hoger percentage levervet bij muizen met NAFLD in vergelijking met controles (tabel 2), wat de pathologie bevestigde. Met behulp van het ExiTron-contrastmiddel en de hierboven beschreven analyse van de levervasculaire netwerkarchitectuur en dichtheid, bleek de totale volumedichtheid van het hepatische vasculaire netwerk hoger te zijn bij muizen met NAFLD in vergelijking met gezonde controles (…

Discussion

De huidige aanbevolen methode voor NAFLD-diagnose en stadiëring bij mensen is leverbiopsie, die het risico op bloedingscomplexiteiten herbergt, evenals bemonsteringsonnauwkeurigheden⁴⁰. Integendeel, in diermodellen wordt een dergelijke diagnose uitgevoerd door histologie post-mortem, hoewel protocollen voor overleefbare leverbiopsie nu beschikbaar zijn en worden aanbevolen wanneer de onderzoeksopzet⁴¹ toestaat. Het gebruik van postmortale histologie betekent dat een groot …

Materials

eXIA160	Binitio Biomedical, Inc.		https://www.binitio.com/?Page=Products
High fat diet with 60% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12492
High-fructose corn syrup	Best flavors, CA	hfcs-1gallon
Lacrinorm ophthalmic ointment	Bausch & Lomb
Normal diet with 10% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12450
Viscover ExiTron nano 12000	Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-698
VivoQuant	Invicro
X-CUBE	Molecubes, Belgium		https://www.molecubes.com/systems/