Nuove tecniche di imaging con tomografia microcomputerizzata in vivo per valutare la progressione della steatosi epatica non alcolica

Summary

Utilizzando un modello murino di steatosi epatica non alcolica (NAFLD) indotto dalla dieta, descriviamo l’uso di nuove tecniche di imaging di tomografia microcomputerizzata in vivo come metodo non invasivo per valutare le fasi di progressione della NAFLD, concentrandoci prevalentemente sulla rete vascolare epatica a causa del suo significativo coinvolgimento nella disregolazione epatica correlata alla NAFLD.

Abstract

La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è un problema di salute globale in crescita e l’impatto della NAFLD è aggravato dall’attuale mancanza di trattamenti efficaci. Considerevoli fattori limitanti che ostacolano la diagnosi tempestiva e accurata (incluso il grading) e il monitoraggio della NAFLD, nonché lo sviluppo di potenziali terapie, sono le attuali inadeguatezze nella caratterizzazione della struttura del microambiente epatico e nella valutazione dello stadio della malattia in modo spazio-temporale e non invasivo. Utilizzando un modello murino di NAFLD indotto dalla dieta, abbiamo studiato l’uso di tecniche di imaging con micro-tomografia computerizzata (TC) in vivo come metodo non invasivo per valutare le fasi di progressione della NAFLD, concentrandoci prevalentemente sulla rete vascolare epatica a causa del suo significativo coinvolgimento nella disregolazione epatica correlata alla NAFLD. Questa metodologia di imaging consente l’analisi longitudinale della steatosi epatica e dell’assorbimento funzionale del tessuto, nonché la valutazione del volume ematico relativo, del diametro della vena porta e della densità della rete vascolare. Comprendere gli adattamenti della rete vascolare epatica durante la progressione della NAFLD e correlarli con altri modi di caratterizzare la progressione della malattia (steatosi, infiammazione, fibrosi) utilizzando il metodo proposto può aprire la strada alla creazione di nuovi approcci più efficienti e riproducibili per la ricerca sulla NAFLD nei topi. Si prevede inoltre che questo protocollo migliorerà il valore dei modelli animali preclinici per lo studio dello sviluppo di nuove terapie contro la progressione della malattia.

Introduction

La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è una malattia metabolica che colpisce circa il 25% della popolazione e il >80% delle persone patologicamente obese¹. Si stima che un terzo di questi individui progredisca verso la steatoepatite non alcolica (NASH), che è caratterizzata da steatosi epatica, infiammazione e fibrosi². La NASH è uno stadio della malattia con un rischio significativamente più elevato di sviluppo di cirrosi e carcinoma epatocellulare (HCC)^3,4. Per questo motivo, la NASH è attualmente la seconda causa più comune di trapianto di fegato e si prevede che presto diventerà anche il più importante predittore di trapianto di fegato ^5,6,7. Nonostante la sua prevalenza e gravità, non è disponibile alcuna terapia specifica per la NAFLD e i trattamenti esistenti mirano solo ad affrontare le patologie associate alla malattia come l’insulino-resistenza e l’iperlipidemia ^5,6.

Negli ultimi anni, il ruolo fisiopatologico e gli adattamenti dell’endotelio e, in generale, della rete vascolare dei tessuti metabolici, come il tessuto adiposo e il fegato, stanno acquisendo maggiore importanza nella ricerca, soprattutto durante l’obesità e la disregolazione metabolica ^7,8. L’endotelio è un monostrato cellulare che riveste internamente la rete vascolare, fungendo da barriera funzionale e strutturale. Contribuisce inoltre a vari processi fisiologici e patologici, come la trombosi, il trasporto di metaboliti, l’infiammazione e l’angiogenesi ^9,10. Nel caso del fegato, la rete vascolare è, tra le altre caratteristiche, caratterizzata dalla presenza di cellule altamente specializzate, definite cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSEC). Queste cellule sono prive di una membrana basale e hanno più fenestrae, consentendo un più facile trasferimento di substrati tra il sangue e il parenchima epatico. A causa della loro posizione anatomica e delle loro caratteristiche distintive, gli LSEC hanno probabilmente un ruolo cruciale nei processi fisiopatologici del fegato, compreso lo sviluppo dell’infiammazione e della fibrosi epatica durante la NAFLD/NASH. Infatti, gli adattamenti patologici, molecolari e cellulari che le LSEC subiscono nel corso della NAFLD contribuiscono alla progressione della malattia¹¹. In particolare, l’angiogenesi epatica LSEC-dipendente che avviene durante la NAFLD è significativamente associata allo sviluppo dell’infiammazione e alla progressione della malattia verso la NASH o addirittura l’HCC¹². Inoltre, la NAFLD precoce correlata all’obesità è caratterizzata dallo sviluppo di insulino-resistenza nelle LSEC, che precede lo sviluppo di infiammazione epatica o altri segni avanzati di NAFLD¹³.

Inoltre, le LSEC sono recentemente emerse come regolatori centrali del flusso sanguigno epatico e degli adattamenti della rete vascolare durante le malattie epatiche di diverse eziologie^14,15. Infatti, la malattia epatica cronica è caratterizzata da una prominente vasocostrizione intraepatica e da una maggiore resistenza al flusso sanguigno, che contribuiscono allo sviluppo dell’ipertensione portale¹⁶. Nel caso della NAFLD, diversi meccanismi correlati alla LSEC contribuiscono a questo fenomeno. Ad esempio, l’insulino-resistenza specifica per LSEC, come accennato in precedenza, è associata a una ridotta vasodilatazione insulino-dipendente della vascolarizzazione epatica¹³. Inoltre, nel corso della malattia, la vascolarizzazione del fegato diventa più sensibile ai vasocostrittori, contribuendo ulteriormente alla compromissione del flusso sanguigno epatico e portando all’insorgenza di stress da taglio, che si traducono entrambi in un’interruzione della microcircolazione sinusoidale¹⁷. Questi fatti suggeriscono che la vascolarizzazione è un bersaglio chiave nelle malattie del fegato. Tuttavia, i fattori limitanti che ostacolano la diagnosi e il monitoraggio tempestivi della NAFLD/NASH, nonché lo sviluppo di potenziali terapie, sono le inadeguatezze nella caratterizzazione coerente del microambiente epatico e della struttura (micro)vascolare, nonché il punteggio dello stadio della malattia in modo spazio-temporale e non invasivo.

L’imaging con tomografia microcomputerizzata (TC) è attualmente il metodo di imaging non invasivo gold standard per rappresentare accuratamente le informazioni anatomiche all’interno di un organismo vivente. La micro-TC e la risonanza magnetica rappresentano due metodi di imaging complementari in grado di coprire una vasta gamma di patologie e fornire una risoluzione e un dettaglio eccezionali nelle strutture e nei tessuti ripresi. La micro-TC, in particolare, è uno strumento molto veloce e preciso che viene spesso utilizzato per studiare patologie come le malattie ossee e le alterazioni della superficie ossea associate¹⁸, valutare la progressione della fibrosi polmonare nel tempo¹⁹, diagnosticare il cancro del polmone e la sua stadiazione²⁰, o ancora esaminare le patologie dentali²¹, senza alcuna particolare preparazione (o distruzione) dei campioni sottoposti a imaging.

La tecnologia di imaging della micro-TC si basa sulle diverse proprietà di attenuazione dei vari organi in termini di interazione dei raggi X con la materia. Gli organi che presentano elevate differenze di attenuazione dei raggi X sono rappresentati con un contrasto elevato nelle immagini TC (ad esempio, i polmoni appaiono scuri e le ossa chiare). Gli organi che presentano proprietà di attenuazione molto simili (tessuti molli diversi) sono difficili da distinguere nelle immagini TC²². Per affrontare questa limitazione, agenti di contrasto specializzati a base di iodio, oro e bismuto sono stati ampiamente studiati per l’uso in vivo . Questi agenti alterano le proprietà di attenuazione dei tessuti in cui si accumulano, vengono eliminati lentamente dalla circolazione e consentono l’opacizzazione uniforme e stabile dell’intero sistema vascolare o dei tessuti scelti²³.

Nella diagnostica umana, l’imaging TC e tecniche analoghe, come la frazione grassa a densità protonica derivata dalla risonanza magnetica, sono già in uso per la determinazione del contenuto di grasso epatico^24,25. Nel contesto della NAFLD, un elevato contrasto dei tessuti molli è essenziale per distinguere con precisione le lesioni patologiche o i piccoli vasi. A tale scopo, vengono utilizzati agenti di contrasto che forniscono un maggiore contrasto delle caratteristiche del tessuto epatico. Tali strumenti e materiali consentono lo studio di molteplici caratteristiche epatiche e di possibili espressioni patologiche, come l’architettura e la densità della rete vascolare, la deposizione/steatosi lipidica e l’assorbimento funzionale del tessuto/trasferimento di lipidi (chilomicroni) nel fegato. Inoltre, è possibile valutare anche il volume ematico relativo epatico e il diametro della vena porta. In un tempo di scansione molto breve, tutti questi parametri forniscono informazioni diverse e complementari sulla valutazione e la progressione della NAFLD, che possono essere utilizzate per sviluppare una diagnosi non invasiva e dettagliata.

In questo articolo, forniamo un protocollo passo-passo per l’uso di nuove tecniche di imaging micro-CT in vivo come metodo non invasivo per valutare le fasi di progressione della NAFLD. Utilizzando questo protocollo, l’analisi longitudinale della steatosi epatica e dell’assorbimento funzionale del tessuto, nonché la valutazione del volume ematico relativo, del diametro della vena porta e della densità della rete vascolare, possono essere eseguite e applicate in modelli murini di malattia epatica.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite dal personale BIOEMTECH in conformità con le normative europee e nazionali in materia di benessere e sono state approvate dalle autorità nazionali (numero di licenza EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Tutti gli esperimenti sono stati progettati e riportati in conformità alle linee guida ARRIVE26. I topi sono stati acquistati dall’Istituto Ellenico Pasteur di Atene, in Grecia. NOTA: Gli animali sono stati alloggiati in gruppo in…

Representative Results

In questo studio rappresentativo, l’imaging micro-CT senza alcun mezzo di contrasto ha indicato una percentuale maggiore di grasso epatico nei topi con NAFLD rispetto ai controlli (Tabella 2), confermando la patologia. Utilizzando l’agente di contrasto ExiTron e l’architettura della rete vascolare epatica e l’analisi della densità sopra descritte, la densità volumetrica totale della rete vascolare epatica è risultata più elevata nei topi con NAFLD rispetto ai controlli sani (Figu…

Discussion

L’attuale metodo raccomandato per la diagnosi e la stadiazione della NAFLD nell’uomo è la biopsia epatica, che comporta il rischio di complessità emorragiche, nonché di imprecisioni di campionamento⁴⁰. Al contrario, nei modelli animali, tale diagnosi viene eseguita mediante istologia post-mortem, anche se sono ora disponibili protocolli per la biopsia epatica sopravvissuta e sono raccomandati quando il disegno dello^{studio lo} consente. L’uso dell’istologia post-mortem sig…

Materials

eXIA160	Binitio Biomedical, Inc.		https://www.binitio.com/?Page=Products
High fat diet with 60% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12492
High-fructose corn syrup	Best flavors, CA	hfcs-1gallon
Lacrinorm ophthalmic ointment	Bausch & Lomb
Normal diet with 10% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12450
Viscover ExiTron nano 12000	Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-698
VivoQuant	Invicro
X-CUBE	Molecubes, Belgium		https://www.molecubes.com/systems/