Nye in vivo mikrocomputertomografibilleddannelsesteknikker til vurdering af progressionen af ikke-alkoholisk fedtleversygdom

Summary

Ved hjælp af en diætinduceret ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) musemodel beskriver vi brugen af nye in vivo mikrocomputertomografibilleddannelsesteknikker som en ikke-invasiv metode til vurdering af progressionsstadierne af NAFLD, overvejende med fokus på det hepatiske vaskulære netværk på grund af dets betydelige involvering i NAFLD-relateret leverdysregulering.

Abstract

Ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) er et voksende globalt sundhedsproblem, og virkningen af NAFLD forværres af den nuværende mangel på effektive behandlinger. Betydelige begrænsende faktorer, der hindrer rettidig og nøjagtig diagnose (herunder klassificering) og overvågning af NAFLD samt udvikling af potentielle terapier, er de nuværende mangler i karakteriseringen af den hepatiske mikromiljøstruktur og scoringen af sygdomsstadiet på en rumlig tidsmæssig og ikke-invasiv måde. Ved hjælp af en diætinduceret NAFLD-musemodel undersøgte vi brugen af in vivo mikrocomputertomografi (CT) billeddannelsesteknikker som en ikke-invasiv metode til at vurdere progressionsstadierne af NAFLD med overvejende fokus på det hepatiske vaskulære netværk på grund af dets betydelige involvering i NAFLD-relateret leverdysregulering. Denne billeddannelsesmetode muliggør langsgående analyse af leversteatose og funktionel vævsoptagelse samt evaluering af det relative blodvolumen, portalvenediameter og densitet af det vaskulære netværk. Forståelse af tilpasningerne af det hepatiske vaskulære netværk under NAFLD-progression og korrelering af dette med andre måder at karakterisere sygdomsprogressionen (steatose, inflammation, fibrose) ved hjælp af den foreslåede metode kan bane vejen for etablering af nye, mere effektive og reproducerbare tilgange til NAFLD-forskning i mus. Denne protokol forventes også at opgradere værdien af prækliniske dyremodeller til undersøgelse af udviklingen af nye terapier mod sygdomsprogression.

Introduction

Ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) er en metabolisk sygdom, der rammer ca. 25% af befolkningen og >80% af sygeligt overvægtige mennesker¹. Det anslås, at en tredjedel af disse personer udvikler sig til ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH), som er karakteriseret ved hepatisk steatose, betændelse og fibrose². NASH er et sygdomsstadium med en signifikant højere risiko for udvikling af cirrose og hepatocellulært karcinom (HCC)^3,4. Af denne grund er NASH i øjeblikket den næsthyppigste årsag til levertransplantation, og det forventes også snart at blive den vigtigste forudsigelse for levertransplantation ^5,6,7. På trods af dens udbredelse og sværhedsgrad er der ingen sygdomsspecifik terapi tilgængelig for NAFLD, og de eksisterende behandlinger sigter kun mod at tackle sygdomsassocierede patologier såsom insulinresistens og hyperlipidæmi ^5,6.

I de senere år har den patofysiologiske rolle og tilpasninger af endotelet og generelt af det vaskulære netværk af metaboliske væv, såsom fedtvæv og lever, fået større betydning i forskning, især under fedme og metabolisk dysregulering ^7,8. Endotelet er et cellulært monolag, der linjer det vaskulære netværk internt og fungerer som en funktionel og strukturel barriere. Det bidrager også til forskellige fysiologiske og patologiske processer, såsom trombose, metabolittransport, inflammation og angiogenese ^9,10. I tilfælde af leveren er det vaskulære netværk blandt andet karakteriseret ved tilstedeværelsen af højt specialiserede celler, defineret som lever sinusformede endotelceller (LSEC’er). Disse celler mangler en kældermembran og har flere fenestrae, hvilket muliggør lettere overførsel af substrater mellem blod og leverparenchyma. På grund af deres karakteristiske anatomiske placering og egenskaber har LSEC’er sandsynligvis en afgørende rolle i leverens patofysiologiske processer, herunder udvikling af leverbetændelse og fibrose under NAFLD / NASH. Faktisk bidrager de patologiske, molekylære og cellulære tilpasninger, som LSEC’er gennemgår i løbet af NAFLD, til sygdomsprogressionen¹¹. Specifikt er den LSEC-afhængige hepatiske angiogenese, der finder sted under NAFLD, signifikant forbundet med udviklingen af inflammation og sygdommens progression til NASH eller endda HCC¹². Desuden er fedmerelateret tidlig NAFLD karakteriseret ved udviklingen af insulinresistens i LSEC’er, som går forud for udviklingen af leverbetændelse eller andre avancerede NAFLD-tegn¹³.

Derudover er LSEC’er for nylig opstået som centrale regulatorer af hepatisk blodgennemstrømning og vaskulære netværkstilpasninger under leversygdom af flere ætiologier^14,15. Faktisk er kronisk leversygdom karakteriseret ved fremtrædende intra-hepatisk vasokonstriktion og øget modstand mod blodgennemstrømning, hvilket bidrager til udviklingen af portalhypertension¹⁶. I tilfælde af NAFLD bidrager flere LSEC-relaterede mekanismer til dette fænomen. For eksempel er LSEC-specifik insulinresistens, som nævnt ovenfor, forbundet med reduceret insulinafhængig vasodilatation af levervaskulaturen¹³. Desuden bliver levervaskulaturen i løbet af sygdommen mere følsom over for vasokonstriktorer, hvilket yderligere bidrager til forringelse af leverblodgennemstrømningen og fører til fremkomsten af forskydningsstress, hvilket begge resulterer i en forstyrrelse af den sinusformede mikrocirkulation¹⁷. Disse fakta tyder på, at vaskulaturen er et centralt mål i leversygdom. Ikke desto mindre er begrænsende faktorer, der hindrer rettidig diagnose og overvågning af NAFLD / NASH samt udviklingen af potentielle terapier, manglerne i den konsekvente karakterisering af det hepatiske mikromiljø og (mikro) vaskulære struktur samt scoring af sygdomsstadiet på en rumlig tidsmæssig og ikke-invasiv måde.

Mikrocomputertomografi (CT) billeddannelse er i øjeblikket den guldstandard ikke-invasive billeddannelsesmetode til nøjagtigt at skildre anatomisk information i en levende organisme. Micro-CT og MR repræsenterer to komplementære billeddannelsesmetoder, der kan dække en lang række patologier og give enestående opløsning og detaljer i de afbildede strukturer og væv. Især mikro-CT er et meget hurtigt og præcist værktøj, der ofte bruges til at studere patologier som knoglesygdomme og tilhørende knogleoverfladeændringer¹⁸, vurdere udviklingen af lungefibrose over tid¹⁹, diagnosticere lungekræft og dens iscenesættelse²⁰ eller endda undersøge tandpatologier²¹ uden nogen særlig forberedelse (eller ødelæggelse) af prøverne, der afbildes.

Billeddannelsesteknologien for mikro-CT er baseret på forskellige organers forskellige dæmpningsegenskaber med hensyn til interaktionen mellem røntgenstråler og stof. Organer med høje røntgendæmpningsforskelle er afbildet med høj kontrast i CT-billeder (dvs. lungerne ser mørke ud og knoglerne lyse). Organer med meget ens dæmpningsegenskaber (forskellige bløde væv) er udfordrende at skelne på CT-billeder²². For at løse denne begrænsning er specialiserede kontrastmidler baseret på jod, guld og vismut blevet grundigt undersøgt til in vivo-brug . Disse midler ændrer svækkelsesegenskaberne af det væv, hvori de akkumuleres, fjernes langsomt fra kredsløbet og muliggør ensartet og stabil opacifikation af hele vaskulærsystemet eller udvalgte væv²³.

I human diagnostik anvendes CT-billeddannelse og sammenlignelige teknikker, såsom MR-afledt protondensitetsfedtfraktion, allerede til bestemmelse af leverfedtindhold^24,25. I forbindelse med NAFLD er høj bløddelskontrast afgørende for nøjagtigt at skelne patologiske læsioner eller små kar. Til dette formål anvendes kontrastmidler, der giver forbedret kontrast mellem levervævets egenskaber. Sådanne værktøjer og materialer muliggør undersøgelse af flere leverkarakteristika og mulige patologiske udtryk, såsom arkitekturen og densiteten af det vaskulære netværk, lipidaflejring / steatose og funktionel vævsoptagelse / lipid (chylomicron) overførsel i leveren. Derudover kan leverens relative blodvolumen og portalvenediameter også evalueres. På meget kort scanningstid giver alle disse parametre forskellige og komplementære oplysninger om evaluering og progression af NAFLD, som kan bruges til at udvikle en ikke-invasiv og detaljeret diagnose.

I denne artikel giver vi en trinvis protokol til brug af nye in vivo mikro-CT-billeddannelsesteknikker som en ikke-invasiv metode til vurdering af progressionsstadierne af NAFLD. Ved hjælp af denne protokol kan den langsgående analyse af leversteatose og funktionel vævsoptagelse samt evalueringen af det relative blodvolumen, portalvenediameter og densitet af det vaskulære netværk udføres og anvendes i musemodeller af leversygdom.

Protocol

Alle procedurer blev udført af BIOEMTECHs personale i overensstemmelse med europæiske og nationale velfærdsbestemmelser og blev godkendt af nationale myndigheder (licensnummer EL 25, BIOexp 45/PN 49553, 21/01/20). Alle eksperimenter blev designet og rapporteret i overensstemmelse med ARRIVE-retningslinjerne26. Musene blev købt fra Hellenic Pasteur Institute, Athen, Grækenland. BEMÆRK: Dyrene blev opstaldet i individuelt ventilerede bure beriget med skinner og papr…

Representative Results

I denne repræsentative undersøgelse indikerede mikro-CT-billeddannelse uden kontrastmiddel en højere procentdel af leverfedt hos mus med NAFLD sammenlignet med kontroller (tabel 2), hvilket bekræftede patologien. Ved anvendelse af ExiTron-kontrastmidlet og hepatisk vaskulær netværksarkitektur og densitetsanalyse beskrevet ovenfor blev den totale volumentæthed af det hepatiske vaskulære netværk fundet at være højere hos mus med NAFLD sammenlignet med raske kontroller (figur…

Discussion

Den nuværende anbefalede metode til NAFLD-diagnose og iscenesættelse hos mennesker er leverbiopsi, som rummer risikoen for blødningskompleksitet samt prøveudtagningsunøjagtigheder⁴⁰. Tværtimod, i dyremodeller udføres en sådan diagnose ved histologi post mortem, selvom protokoller for overlevelsesdygtig leverbiopsi nu er tilgængelige og anbefales, når undersøgelsesdesignet tillader⁴¹. Anvendelsen af post mortem histologi betyder, at et stort antal dyr er forpligte…

Materials

eXIA160	Binitio Biomedical, Inc.		https://www.binitio.com/?Page=Products
High fat diet with 60% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12492
High-fructose corn syrup	Best flavors, CA	hfcs-1gallon
Lacrinorm ophthalmic ointment	Bausch & Lomb
Normal diet with 10% of kilocalories from fat	Research Diets, New Brunswick, NJ, USA	D12450
Viscover ExiTron nano 12000	Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-698
VivoQuant	Invicro
X-CUBE	Molecubes, Belgium		https://www.molecubes.com/systems/