Summary
이 연구에서는 첫 번째 상악 어금니 주위에서 14일 동안 Porphyromonas gingivalis에서 추출한 지질다당류의 유지 합자와 반복 주사의 조합을 통해 치주염 유도의 쥐 모델을 제시합니다. 결찰 및 LPS 주사 기술은 치조골 손실과 염증을 유발하는 근막염 유도에 효과적이었습니다.
Abstract
치주염(PD)은 치주 연조직, 치주 인대, 시멘트질 및 치조골의 손실을 초래하는 매우 만연한 만성 면역 염증성 질환입니다. 본 연구에서는 랫트에서 PD를 유도하는 간단한 방법을 설명한다. 우리는 첫 번째 상악 어금니(M1) 주위에 합자 모델을 배치하고 M1의 근심-구개 쪽에 있는 Porphyromonas gingivalis 에서 파생된 지질다당류(LPS) 주사의 조합에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 치주염의 유도는 14일 동안 유지되어 박테리아 생물막의 축적과 염증을 촉진하였다. 동물 모델을 검증하기 위해 주요 염증 매개체인 IL-1β를 치은 틈새액(GCF)에서 면역분석법으로 측정하고 원뿔형 컴퓨터 단층촬영(CBCT)을 사용하여 치조골 손실을 계산했습니다. 이 기술은 14일 후 실험 절차 종료 시 치은 후퇴, 치조골 손실 및 GCF의 IL-1β 수준 증가를 촉진하는 데 효과적이었습니다. 이 방법은 파킨슨병 유도에 효과적이어서 질병 진행 기전 및 향후 가능한 치료법에 대한 연구에 사용할 수 있습니다.
Introduction
치주염(PD)은 전 세계적으로 6번째로 널리 퍼진 공중 보건 질환으로, 전체 인구의 약 11%에 영향을 미치며, 진행성, 비가역적, 파괴적 형태의 치주 질환이다 1,2. PD는 치은 및 치주 조직에 영향을 미치는 염증 과정으로, 치은 후퇴, 포켓 발달을 동반한 접합 상피의 정점 이동, 치조골 손실을 초래합니다3. 또한, 파킨슨병은 심혈관 질환, 비만, 당뇨병 및 류마티스 관절염을 포함한 여러 전신 질환과 관련이 있으며, 환경 및 숙주 특이적 요인이 중요한 역할을 한다 4,5.
따라서, PD는 주로 미생물 군집의 dysbiosis로 인한 미생물 플라크의 축적과 치주 병원체에 대한 과장된 숙주 면역 반응에 의해 시작되어 치주 조직의 파괴를 초래하는 다인성 질환입니다 4,6. 여러 치주 박테리아 중에서 그람 음성 혐기성 박테리아인 Porphyromonas gingivalis는 PD4의 주요 병원체 중 하나입니다. P. gingivalis는 염증이 있는 치주 조직에서 다형핵 백혈구 침윤 및 혈관 확장을 유도하는 것으로 알려진 분자인 복합 지질다당류(LPS)를 벽에 함유하고 있다7. 그 결과 인터루킨 1(IL-1), IL-6, IL-8과 같은 염증 매개체, 종양 괴사 인자(TNF) 또는 프로스타글란딘이 생성되어 파골세포가 활성화되고 뼈 흡수가 일어나 조직 파괴와 궁극적인 치아 손실이 발생합니다3.
동물 모델의 다양한 장점 중에는 인간에서와 같이 세포 복잡성을 모방할 수 있는 능력, 또는 제한된 세포 유형의 플라스틱 표면에서 수행되는 시험관 내 연구보다 더 정확하다는 점이 있다8. 생체 내에서 PD를 실험적으로 모델링하기 위해 인간이 아닌 영장류, 개, 돼지, 흰 족제비, 토끼, 생쥐 및 쥐와 같은 다양한 동물 종이 사용되었습니다9. 그러나, 래트는 파킨슨병의 발병기전에 대해 가장 광범위하게 연구된 동물 모델인데, 그 이유는 이들이 저렴하고 다루기 쉽기 때문이다10. 그들의 치은 조직은 인간의 치은 조직과 유사한 구조적 특징을 가지고 있으며, 얕은 치은 고랑과 접합 상피가 치아 표면에 부착되어 있습니다. 또한, 인간과 마찬가지로 접합 상피는 염증 세포에서 박테리아, 이물질 및 삼출물의 통과를 촉진한다 9.
쥐의 PD 유도에 대해 가장 많이 보고된 실험 모델 중 하나는 치아 주위에 합자를 배치하는 것인데, 이는 기술적으로 어렵지만 신뢰할 수 있습니다10. 합자 배치는 치태와 박테리아 축적을 촉진하여 치주 조직 염증 및 파괴를 유발하는 치은 고랑에 dysbiosis를 생성합니다11. 치주 부착의 상실 및 치조골의 재흡수는 이 쥐 모델8에서 7일 이내에 발생할 수 있다.
PD에 대한 또 다른 동물 모델은 치은 조직에 LPS를 주입하는 것으로 구성됩니다. 결과적으로 파골 세포 형성과 뼈 손실이 자극됩니다. 이 모델의 조직병리학적 특징은 더 높은 수준의 전염증성 사이토카인, 콜라겐 분해 및 치조골 흡수를 특징으로 하는 인간이 확립한 PD와 유사합니다 6,8.
따라서 본 연구의 목적은 제1 상악 어금니(M1) 주위의 합자 배치와 결합된 P. gingivalis-LPS(Pg-LPS) 주사 기술을 기반으로 한 실험 PD의 간단한 쥐 모델을 설명하는 것이었습니다. 이것은 인간 PD 질환에서 관찰되는 것과 유사한 특성을 가진 모델로, 질병 진행 메커니즘 및 향후 가능한 치료법 연구에 사용될 수 있습니다.
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Protocol
참고: 연구의 실험 프로토콜은 발레아레스 제도 보건 연구소의 동물 실험 윤리 위원회(CEEA-UIB, 참조 번호 163/03/21)의 승인을 받았습니다.
1. 동물 마취 및 시술 준비
- 수술 전 모든 수술 기구(알루미늄 입 개그, 치과 탐험가, 다이아몬드 랜스, 수술용 가위, 미세 수술용 펜치, 마이크로 바늘 홀더, 홀렌백 조각기, 골막 미세 수술 엘리베이터, 미세 수술 가위)(135°C에서 5분)를 소독합니다.
- 설명 된대로 멸균 상태에서 절차에 필요한 모든 용액을 준비하십시오.
- 인산염 완충액(PBS)/식염수에 희석한 60mL의 케타민과 8mL의 케타민과 1.6mL의 자일라진을 혼합하여 케타민(1mg/mL)과 자일라진(1mg/mL)의 혼합물을 준비합니다. 스톡을 4 °C에서 보관하십시오.
- 아티파메졸을 PBS/식염수에 0.25mg/mL의 최종 농도로 희석합니다. 스톡을 4 °C에서 보관하십시오.
- 부프레노르핀을 PBS/식염수에 0.03mg/mL의 최종 농도로 희석합니다. 스톡을 4 °C에서 보관하십시오.
- 멸균 식염수에 Pg-LPS(1mg/mL) 1mL를 준비합니다. 스톡을 -20 °C에서 보관하십시오.
- 실험을 위해 수술 당시 12 주령과 체중 210-350g의 암컷 및 수컷 Wistar 쥐를 사용하십시오. 적절한 환경과 일정한 조건(20-24°C, 하루 명암 주기당 12시간)에서 동물을 그룹으로 수용하고 음식과 표준 물을 임의로 제공하십시오.
- 마취를 유도하기 위해 쥐의 체중을 측정하고 25G 멸균 피하 주사 바늘과 1mL 주사기를 사용하여 80/10mg/kg 농도의 케타민/자일라진 혼합물을 복강내(IP) 투여합니다.
- 쥐를 마취시킨 후, 동물을 가열 된 수술 플랫폼에 등을 대십시오. 시술 과정에서 열 손실을 막기 위해 동물의 몸을 덮으십시오.
참고: 마취 깊이는 시술 중 페달 반사의 상실과 활력 징후를 모니터링하여 평가됩니다. 필요한 경우 작은 노즈 콘을 사용하여 100% 산소에 2% 이소플루란으로 마취를 유지합니다. 마취유도 후 양쪽 눈에 멸균 안과용 연고를 발라 각막을 보호하고 건조를 방지한다. - 시술 중 작은 노즈콘을 이용하여 100% 산소를 투여하고 맥박산소측정기로 맥박수와 산소포화도를 모니터링한다.
알림: 산소 포화도와 맥박수가 각각 95% 및 190bpm 미만으로 떨어지면 절차를 중단하고 정상 값에 도달할 때까지 동물을 측면 욕창 위치에 놓습니다. - 앞니(상하)에 알루미늄 입 개그를 사용하여 쥐 입을 열고 혀를 집어넣고 상악과 하악을 개방적이고 편안한 작업 자세로 안정화하여 하악 어금니에 접근할 수 있도록 합니다.
참고: 동물을 측면 데쿠비투스에 배치해야 하는 경우 회복을 위해 위치를 변경하기 전에 입 개그를 제거하십시오. 동물이 마취되면 수술 전에 치은 열구액(GCF)을 수집합니다(기저 조건의 샘플)(0일). - 다음 단계에 설명된 대로 GCF를 수집합니다.
- 동물을 수술 플랫폼에 등을 대고 알루미늄 입 개그로 열린 자세로 상악과 하악을 안정시킵니다.
- 총 4개(각 M1에 대해 2개)의 흡수성 종이 점 nº 30(직경 0.03cm x 길이 3cm)을 사용하여 GCF를 M1의 근심구개 주위의 치은 틈새(치은 상피와 인접한 법랑질 사이의 공간)에 삽입하여 수집합니다. 용지 포인트를 총 30초 동안 동일한 위치에 유지한 후 즉시 제거하십시오.
- 수집 후 종이 포인트를 즉시 플라스틱 바이알에 옮기고 분석이 수행될 때까지 -80°C에서 보관합니다.
2. 보유 합자 기술 및 치은 연내 Pg-LPS 주입
참고: 합자 모델은 미세 수술 기구를 사용하여 치은 고랑 내 M1 주위에 양측으로 멸균 편조 실크 합자(5/0)를 배치하고 구개 표면에 외과의의 매듭으로 고정하여 생성되었습니다(0일). 사용된 미세 수술 기구는 미세 수술용 펜치, 마이크로 바늘 홀더, 홀렌백 조각기, 골막 미세수술 엘리베이터 및 미세 수술 가위였습니다. LED 광원이 있는 수술용 확대경도 사용되었습니다(3.6배 배율).
- 봉합사의 원위 꼬리를 치열의 구개 쪽에 놓고 M1과 제2 상악 어금니(M2)의 접촉 사이에 근위 부분을 삽입합니다.
- 골막 미세 수술 엘리베이터를 사용하여 고랑 내에 봉합사를 삽입합니다. 이 수준의 조직은 부착된 치은의 좁은 영역을 나타내므로 M1의 협측 표면 주위에 합자를 매우 조심스럽게 감쌉니다. 구개 측면에서는 봉합사가 잇몸 고랑으로 들어가도록 양쪽 끝이 조여졌는지 확인하십시오.
알림: M1과 M2 사이에 봉합사를 삽입할 때 저항이 관찰되면 치과용 탐색기와 다이아몬드 랜스 모양의 버를 사용하여 접점을 약간 열 수 있습니다. - 봉합사의 끝을 외과 의사의 매듭으로 묶고 꼬리를 가능한 한 짧게 자릅니다. 고랑에 매듭을 삽입하십시오.
알림: 수술 기구의 팁은 구강 외상과 출혈을 유발할 수 있습니다. 구강에서 혈액을 제거하기 위해 작은 부분의 거즈 또는 면봉을 준비하고 출혈을 멈추기 위해 압력을 가하십시오. 미세 수술 접근법을 통한 신중한 연조직 관리는 수술 합병증을 최소화하고 조직 외상을 줄입니다. - 합자 위치 지정 후, 25G 멸균 피하 주사 바늘과 1mL 주사기를 사용하여 멸균 식염수에 40μL의 Pg-LPS를 M1의 근위-구개 쪽에 있는 치은연하 조직(치아의 뿌리 또는 목과 잇몸 가장자리 사이)에 양측으로 주입합니다(0일).
3. 절차 종료
- 결찰 위치 지정 및 Pg-LPS 적용 후 수술 상태에서 쥐를 풀어주고 열 램프 아래의 깨끗한 개별 케이지에 넣습니다.
- 길항제 아티파메졸(0.5mg/kg 피하(SC))에 25G 멸균 피하 주사 바늘과 1mL 주사기를 주사합니다.
- 통증 완화를 위해 0.03mg/kg 부프레노르핀, SC를 주사하십시오.
- 수술의 효과가 완전히 바뀔 때까지 동물의 회복을 모니터링하십시오. 일정한 조건(20-24°C, 하루 명암 주기당 12시간)에서 적절한 환경에 각 쥐를 개별적으로 수용합니다. 음식과 탈이온수를 임의로 제공하십시오.
- 시술 후 처음 2일 동안 동물의 체중을 측정하고 통증 완화를 위해 Buprenorphine SC를 하루에 두 번 주사합니다.
참고: 와인드업 효과를 제거하기 위해 절차를 시작하기 전에 부프레노르핀을 투여할 수 있습니다. - 실험 시간 동안, 일주일에 한두 번 체중 및 일반적인 행동 평가에 의해 동물을 모니터링한다.
4. 시술 후 후속 조치
참고: PD의 유도는 박테리아 생물막의 축적과 그에 따른 염증을 촉진하기 위해 14일 동안 유지되었습니다. 합자를 검사하고 조정해야 하며 Pg-LPS는 일주일에 세 번(2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일) 주사됩니다.
- 합자(2일차, 4일차, 6일차, 8일차, 10일차, 12일차)를 다음과 같이 검사하고 조정합니다.
- 마취 유도 챔버를 사용하여 100% 산소에 2% 이소플루란으로 마취합니다.
- 쥐를 마취 한 후, 동물을 등에 대고 동물 마취 유지를 위해 100 % 산소에 1 % 이소 플루 란을 사용하여 시술 중에 작은 코 콘을 사용하십시오.
- 앞니(상하) 주위의 알루미늄 입 개그를 사용하여 쥐 입을 열고 혀를 수축시키고 상악과 하악을 개방적이고 편안한 작업 자세로 안정화하여 합자에 접근할 수 있도록 합니다.
- 골막 미세 수술 엘리베이터를 사용하여 치은에 대한 합자를 조이고 합자의 봉합사가 삽입되어 치은 주위에 염증을 유발하는지 확인합니다.
참고: 수술 후 7-10일이 지나면 합자가 손실될 수 있습니다. 이 경우 Pg-LPS 주입에 대해 설명된 프로토콜을 따르십시오(2.4단계).
- 합자 조정 후, M1의 중구개 쪽에 있는 치은연하 조직에 25G 멸균 피하 주사 바늘과 1mL 주사기가 있는 Pg-LPS 40μL를 양측 주사합니다(2일, 4일, 6일, 8일, 10일 및 12일).
- 마취를 위해 코 콘을 제거하고 쥐를 새장에 넣으십시오. 마취 효과가 완전히 바뀔 때까지 동물의 회복을 모니터링하십시오.
5. 동물 희생과 분석
참고: PD의 진행을 평가하기 위한 다양한 옵션이 있습니다. 여기에서 설명된 분석은 치은 열구액(GCF)에서 전염증성 사이토카인의 평가와 치조골의 손실 평가로 구성됩니다.
- 연구의 14일째(14일째)에, 동물을 이산화탄소 챔버에서CO2로 희생시켰다. 설치류의 경우 챔버 부피/분의 30%에서 70%의 변위 비율을 권장합니다.
참고: 안락사를 확인하려면 페달 반사에 대한 동물 반응의 부족과 활력 징후의 부재를 확인해야 합니다. - 다음 단계에 설명된 대로 GCF를 수집합니다.
참고: GCF는 PD 유도 전(수술 전)(0일) 및 PD 유도 후(희생 후)(14일)에 수집됩니다.- 동물을 수술 플랫폼에 등을 대고 알루미늄 입 개그로 열린 자세로 상악과 하악을 안정시킵니다.
- GCF를 M1의 mesio-palatal 주위의 치은 틈새에 삽입하여 30번 점(직경 0.03cm x 길이 3cm)의 흡착지를 사용하여 약간의 저항이 있을 때까지 수집합니다. 용지 포인트를 총 30초 동안 동일한 위치에 유지한 후 즉시 제거하십시오.
- 수집 후 종이 포인트를 즉시 플라스틱 바이알에 옮기고 분석이 수행될 때까지 -80°C에서 보관합니다.
- GCF 내에서 단백질을 평가하려면 다음 용액을 준비하고 설명된 대로 용출 방법의 단계를 따르십시오.
참고: IL-1β는 제조업체의 프로토콜에 따라 면역분석법을 사용하여 GCF(14일)에서 평가됩니다.- 용출 완충액을 신선하게 준비하고 전체 추출 과정에서 얼음 위에 보관하여 프로테아제 활성을 억제합니다.
- 설명된 대로 용리 버퍼에 필요한 모든 용액을 준비합니다.
- 초순수에 아프로티닌 1mL(1mg/mL)를 준비합니다.
- 메탄올에 10mL의 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)(200mM)를 준비합니다.
- PBS 용액 24.5mL(pH = 7.4)에 PMSF 125μL와 아프로티닌 250μL를 넣어 용출 완충액을 제조합니다.
- 상용 포스파타제 억제제 정제 1개를 4°C에서 10분 동안 교반하면서 새로 제조된 용출 완충액 10mL와 함께 용해시킵니다.
참고: GCF 용출 기간은 제한되어 있습니다. 처음 30분 이내에 포스파타제 억제제 정제를 첨가한 후 원심분리에 즉시 사용하십시오. - 포스파타제 억제제를 첨가한 후, 11 μL의 완전 용출 완충액을 종이 뾰족한 튜브에 직접 첨가합니다.
- 튜브를 452 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 용출된 내용물을 새 플라스틱 바이알에 옮깁니다. 이 과정을 4회 더 반복하여 총 부피 50μL를 산출합니다.
- 마지막 원심분리 후 총 부피 60μL를 종이 지점에 직접 추가하고 4°C에서 5분 동안 452 x g 에서 마지막으로 한 번 더 원심분리합니다.
- 단백질 평가를 위해 용리된 필요한 부피를 사용합니다.
- 안락사와 GCF 수집 후 수술 가위를 사용하여 쥐의 상부 턱을 잘라냅니다. 쥐의 가면을 벗겨 내고 가능한 한 작은 연조직을 남겨 두십시오.
- 시각화를 위해 현미경 단계에 턱을 배치하고 원하는 배율로 사진을 찍습니다.
- PBS에 희석된 4% 파라포름알데히드(PFA)에 턱을 직접 넣습니다. 완전한 고정을 위해 12일 동안 새 PFA로 일주일에 두 번 새로 고칩니다.
주의 : PFA와 관련된 단계는 안전 보건 자료 권장 사항에 따라 흄 후드에서 수행해야 합니다. - 턱을 완전히 고정한 후 다음과 같이 원뿔형 컴퓨터 단층 촬영(CBCT) 스캐너를 사용하여 뼈 손실을 평가합니다.
- PC를 엽니다.
- CBCT 분석 프로그램을 엽니다.
- Scan Protocol(스캔 프로토콜) > Denture Scan Mode(의치 스캔 모드)를 선택합니다.
- 시야각(FOV) > (11x8) HIRes(90kV 전압 및 3mA 전류)를 선택합니다.
- 갠트리에 쥐의 고정 된 상악골을 놓습니다.
- 다음을 클릭합니다.
- X선 발사 버튼을 클릭합니다(X선 리모콘을 눌러 방출을 하고 스캔하는 전체 시간 동안 계속 누르고 있음).
- 필요한 경우 제어 버튼을 눌러 상악을 정면 중앙으로 재배치한 다음 X 선 발사 버튼을 클릭합니다(X선 리모콘을 눌러 방출을 하고 전체 스캔 기간 동안 계속 누르고 있음).
- 다음을 클릭합니다.
- X선 발사 버튼을 클릭합니다(X선 리모콘을 눌러 방출을 하고 스캔하는 전체 시간 동안 계속 누르고 있음).
- 필요한 경우 제어 버튼을 눌러 시상면 중앙에 의치를 재배치한 다음 X 선 발사 버튼을 클릭합니다(X선 리모콘을 눌러 방출을 하고 전체 스캔 기간 동안 계속 누르고 있음).
- 다음을 클릭합니다.
- 시작 버튼을 클릭합니다(X선 리모콘을 눌러 방출을 하고 전체 검사 기간 동안 계속 누르고 있음). 처리 메시지가 수신될 때까지 기다린 후 표시된 지침을 따릅니다.
- 창 보기가 나타납니다. 회색을 65%로 조절하고 적용을 클릭합니다.
- 스캔을 저장하려면 파일을 클릭하고 DICOM 형식으로 저장하십시오. 그런 다음 모든 이미지( All Images )를 클릭하고 DICOM 내보내기 선택 창에서 표시된 모든 매개변수(초기 이미지, 원본 축방향, 재포맷된 축방향, 다중 평면)를 선택하고 미리 정의된 유형을 선택합니다.
- 상악어금니의 2차원 및 시상 대표 이미지를 다음과 같이 분석 프로그램을 사용하여 처리합니다.
- 소프트웨어를 엽니 다.
- 파일 및 열기를 클릭한 다음 DICOM 형식의 이미지가 있는 폴더를 선택하고 열기를 클릭합니다.
- "8비트로 변환" 창이 나타날 때까지 기다렸다가 0에서 6,000 사이의 범위를 선택하고 확인을 클릭합니다.
- Raw 이미지를 클릭합니다.
- 선택 영역의 위쪽과 아래쪽을 정의하여 관심 영역을 제한합니다. 치조골이 나타나는 첫 번째 이미지와 마지막 이미지를 검색하고 선택 명령의 맨 위 와 맨 아래에서 선택합니다.
참고: 어금니의 치조골의 대표적인 2차원 이미지는 그림 3A,B에서와 같이 내보낼 수 있습니다. - 시상 대표 이미지의 경우 프로필 표시줄 토글을 클릭합니다.
- 구개 중간에 시상선을 그리고 모델 슬라이스 재생(Reslice model)을 클릭합니다. 관심 영역을 구분하기 위한 매개 변수(슬라이스 간격: 1, 슬라이스 수: 100)를 결정하고 [확인]을 클릭합니다. 리슬라이싱 모델이 끝날 때까지 기다립니다. 마지막으로 Resliced 이미지 저장을 클릭합니다.
참고: 어금니의 치조골에 대한 대표적인 시상 상상은 그림 3C,D에서와 같이 내보낼 수 있습니다.
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Representative Results
실험 단계의 타임라인은 그림 1에 나와 있습니다. 그림 2A 는 실험 시간 0에서 M1의 고랑 주위에 합자가 배치된 외과적 개입 후 하악의 이미지를 보여줍니다. 그림 2B 는 시술 14일 후 M1 주변의 합자가 치은 고랑으로 들어가 치은의 염증을 유발하고 침윤성 축적을 일으키는 방법을 보여줍니다.
그림 1: 쥐의 치주염(PD) 유도 실험 절차 타임라인의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대표적인 2차원 이미지(그림 3, 빨간색 사각형)는 기저 대조군 사이의 하악골 손실 차이를 보여 더 많은 뼈 부피(그림 3A)를 나타내고 PD 확립 후 더 높은 치조골 손실을 보여줍니다(그림 3B). 또한, 시상 이미지를 분석한 결과, 기저 대조군(그림 3C)과 비교하여 PD 확립 후 M1(그림 3D, 빨간색 화살표) 및 M2(그림 3D, 녹색 화살표)의 신경근간 뼈 영역에서 더 큰 폐포 뼈 손실이 강조됩니다. 또한, 치조골 흡수는 시멘트 법랑질 접합부(CEJ)와 치조골 능선(ABC) 사이의 공간 증가를 특징으로 합니다. 두 쥐 그룹에서 CEJ와 ABC 사이의 거리는 그림 3C, D에 파란색 화살표로 표시되어 있습니다. 확립 된 PD는 기초 대조군 (그림 3C)에 비해 CEJ와 ABC (그림 3D) 사이에 넓은 공간을 개발했습니다.
희생의 순간, 구개 이미지는 다른 그룹에서 M1의 치은 후퇴의 차이를 나타냈다(그림 4A, B). PD 그룹(그림 4B)은 기저 대조군(그림 4A)에 비해 뼈 지지의 손실과 치근 노출로 인해 더 큰 치단 치은 이동을 보여줍니다. 또한, PD 그룹(그림 4B)은 기저 대조군(그림 4A)에 비해 상악 어금니 주위의 치은 염증이 더 컸습니다. 도 4C 는 GCF로부터 전염증성 사이토카인인 IL-1β를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 대조군에 비해 PD군에서 현저히 높은 IL-1β 방출을 보여준다. 문헌에 따르면, IL-1β는 치주염에서 염증, 면역 조절 및 골 흡수에 관여하며, 치주 조직 파괴의 강력한 자극제이다12.
그림 2: 서로 다른 시간에 M1의 고랑에 삽입된 합자의 이미지. (A) 합자 삽입 후 0일 동안 M1 주위에 합자가 배치된 쥐 구개. (B) 합자 삽입 후 14일 동안 M1 주위에 합자가 배치된 쥐 구개. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 치조골과 상악어금니의 대표적인 2차원 이미지. (A) 기저 대조군 및 (B) 합자 삽입 및 Pg-LPS 주입으로 14일 동안 확립된 치주염(PD)의 상악어금니(빨간색 사각형)의 폐포골의 CBCT로 얻은 대표적인 이차원 사진. (C) 기저 조절 및 (D) PD의 상악 어금니의 대표적인 시상 이차원 보기. 빨간색 화살표는 M1의 근막간 치조골 면적을 나타내고, 파란색 화살표는 CEJ와 ABC 사이의 거리를, 녹색 화살표는 M2의 근막간 치조골 면적을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 구개의 대표 이미지. 대표적인 이미지는 (A) 기저대조군 및 (B) 치주염(PD)군을 희생시킨 후, 14일간 인대 삽입 및 Pg-LPS 주입으로 처리한 후의 구개골이다. (C) 기저 대조군 및 PD 그룹의 GCF에서 IL-1β 농도의 결정 (n = 9). 데이터는 SEM± 평균을 나타낸다. 결과는 Kruskal-Wallis에 의해 통계적으로 비교되었다: *p < 0.05 PD 그룹 대 기저 대조군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법은 Pg-LPS 주사와 M1 주위에 합자 배치를 결합한 기술에 따라 쥐에서 PD의 유도를 설명하며, 이 방법 후 14일 이내에 치주 조직과 치조골의 상당한 변화가 유도될 수 있음을 보여줍니다.
이 절차 중에 다른 중요한 단계에 주의를 기울여야 합니다. 동물 마취 및 시술 준비 중에 동물의 올바른 위치를 보장하고, 앞니 주위에 알루미늄 입 개그로 열린 쥐 입을 안정화하고, 개그와 수술 도구로 동물이 다치는 것을 방지하는 것과 마찬가지로 수술 과정에서 적절한 마취를 평가하는 것이 성공에 매우 중요합니다. 산소 포화도와 맥박수가 떨어지면 절차를 중단하고 정상 값에 도달 할 때까지 동물을 측면 욕창 위치에 놓아야합니다. 합자 자세를 취하는 동안 다른 부위의 통증과 염증을 예방하기 위해 연조직 손상을 최소화해야 한다는 점을 고려하여 봉합사와 매듭을 고랑에 올바르게 삽입하는 것이 중요합니다. 동물의 복지와 관련된 윤리적 문제를 고려할 때 마취 효과가 완전히 바뀔 때까지 동물의 회복을 모니터링하는 것이 필수적입니다. 시술 후 처음 2 일 동안 진통제는 필수 불가결합니다. 쥐가 절차를 얼마나 잘 견디고 극심한 고통을 나타내지 않는지 평가하기 위해 동물의 체중과 행동을 모니터링하는 것도 중요합니다. 시술 후 Pg-LPS 주입 및 M1 주변 치은연하 조직에 대한 합자 조정 중에 먼저 염증을 생성하기 위해 정점 위치에서 합자를 조이고 재배치하는 것이 중요합니다. 둘째, 구강 외상을 일으키지 않도록 Pg-LPS를 양측으로 조심스럽게 주입하는 것이 중요합니다. 또한 동물을 마취하는 동안주의를 기울여야하며 회복 될 때까지 모니터링해야합니다. GCF를 수집하는 동안 보정된 종이는 동일한 총 시간 동안 동일한 위치에 유지되어야 하며 mesio-palatal M1 주변의 동일한 치은 틈새에 삽입하는 것이 중요합니다. GCF 용출 단계 동안, 시판되는 포스파타제 억제제 정제를 첨가한 직후에 용출 완충액을 사용하는 것이 중요하다. 프로토콜의 마지막 중요한 단계는 CBCT 스캔 중입니다. 샘플과 분석 프로토콜의 적절한 정렬은 해석 가능한 결과를 얻는 데 중요합니다.
Pg-LPS 주사에 대한 각 동물의 특정 노출의 변화와 M1 주변의 유지 합자가 올바른 염증과 그에 따른 골 흡수를 달성하지 못하는 이유로 포함될 수 있습니다. 이 절차를 사용하여 PD 유도에서 좋은 결과를 얻을 수 있지만 프로토콜을 면밀히 준수하여 동물 간의 변이를 밀접하게 줄이는 것이 중요합니다. 이 방법의 가장 중요한 수정 중 하나는 문헌13,14,15에서 가장 전통적인 합자 모델인 M2 주위가 아니라 M1 주위에 머무름 합자를 배치하는 것입니다. 생쥐 또는 쥐에서 합자 배치를 위한 수술 절차는 기술적인 어려움을 나타내며, 쥐 구강과 치아의 크기가 작기 때문에 많은 연구자들에게 잠재적인 도전을 나타낸다11,16. 쥐를 사용하고 M1 주위에 합자를 배치하면 해당 부위에 대한 조작 및 접근이 용이 해졌으며 시술 중 동물의 스트레스도 감소했습니다. 프로토콜 동안 동물의 고통은 관찰되지 않았지만 쥐가 고통의 징후를 보이면 고통을 예방하기 위해 실험에서 제거하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 절차의 가장 제한적인 단계는 수술 후 7-10 일 후에 발생할 수있는 합자의 손실을 피하는 것입니다. 시간이 지남에 따라 질병의 강도를 증가시키고 유지하려면, 동물 간의 치주염 유도 강도의 변동성을 완화하여 치은 조직과의 친밀한 접촉을 유지하도록 합자를 조정하는 것이 중요하다15. 일반적으로 절차가 올바르게 수행되면 수정이 필요하지 않으며 일관된 결과를 얻을 수 있습니다.
이 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 우선, 외상성 손상(합자 위치)으로 인한 파킨슨병 연구를 위한 기술이 개발되었는데, 이는 박테리아의 국소 축적을 촉진하여 박테리아 매개 염증 및 뼈 손실을 향상시키는 것으로 생각됩니다13,10, Pg-LPS 주사의 조합. 그러나 사실,이 방법은 인간 치주염에서 미생물 불균형의 원인이되는 자연적 원인을 모방하지 않으며 치주염이 발생할 수있는 몇 가지 다른 가능한 메커니즘을 모방하지 않습니다. 또한, 쥐의 치아 구조는 인간15과 동일하지 않다. 또한, 제시된 방법은 급성 PD를 연구하는 데 효과적이지만 만성 PD16에서 장기적인 골 손실 및 염증 침윤 특성을 반영하지 않을 수 있습니다. 치조골 손실 평가를 위해 제안된 방법론을 자세히 살펴보면 뼈의 다차원 평가에 가장 일반적으로 사용되는 방법은 외부 요인을 평가하고 뼈의 3차원 이미지를 제공하는 micro-CT입니다. 부가적으로, 섬유주 골 파라미터, 골 부피 및 골 미네랄 밀도는 뼈를 파괴하지 않고 분석될 수 있다(14,17). 그러나 치조골 손실 평가를 위한 CBCT의 사용이 마이크로 CT의 대안으로 여기에서 제안되었습니다(그림 3). 비록 저해상도 영상이 얻어지지만, 그것은 또한 치주염 진행의 유용한 정성적 및 정량적 분석을 제공한다18,19,20. 따라서 CBCT 검사는 쥐의 치주염 유도 연구를 용이하게 하는 마이크로 CT보다 더 유용하고 접근하기 쉬운 정확한 이미징 방법을 제공합니다.
잘 제어된 조건 하에서 치아 지지 조직(치은 및 뼈)을 평가하기 위해 생체 내에서 PD를 모방하는 데 사용된 다양한 동물 모델 16 중에서, 합자 유도 PD 모델은 쥐, 개 및 비인간 영장류에서 광범위하게 사용되었다13. 문헌은 또한 일부 프로토콜에서 사용되고 있음에도 불구하고 편리하고 저렴하며 다재다능한 모델을 나타내는 마우스를 사용하면 쥐에 비해 마우스 구강의 크기가 상대적으로 작기 때문에 더 기술적인 문제가 발생한다고 지적합니다13. 다른 모델과 비교하여 합자 유도 PD 쥐 모델은 예측 가능한 시간에 시작하여 며칠 내에 치조골 손실로 절정에 달할 수 있는 신속한 질병 유도를 포함하여 몇 가지 이점을 제공합니다(생쥐 및 쥐)13. 이 방법은 치주 조직과 치조골 재생을 연구할 수 있는 능력, 염증 정도를 평가하기 위해 염증이 있는 치은 조직을 찾아 해부할 수 있는 능력 등 다른 장점이 있다15. 합자 유도 PD 모델을 LPS 주사와 결합하는 방법은 합자에 의해 생성된 결합 조직 부착 및 폐포 골 흡수의 손실을 향상시키는 치주염에 국소 파괴적인 염증 반응을 추가합니다. 이러한 부가효과는 LPS 주입제의 농도와 빈도에 따라 증가하는 것이 좋다10. 여기에 보고된 방법은 두 방법의 장점과 중요성과 함께 합자와 Pg-LPS 주입의 조합에 대한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.
PD의 안전하고 경제적인 생체 내 모델의 최적화 및 개발은 치주 질환의 발병기전을 이해하고 새로운 치료 접근법을 테스트하는 데 중요합니다. 여기에 제시된 M1 주변의 Pg-LPS 주사 및 합자 배치의 결합 기술의 PD 모델은 숙주-미생물 상호 작용, 치주염의 염증 및 폐포 골 흡수를 조사하기 위한 매력적인 연구 모델로 평가됩니다. 이 모델은 프로토콜의 가장 중요한 세트를 식별하고, 이미지 기반 기술 세부 사항으로 설명하고, 이러한 결합된 기술의 사용을 표준화 및 최적화합니다. 치조골과 주변 부착 치은의 조직학적 분석, 염증과 관련된 다른 사이토카인의 측정, 구강 미생물총의 특성화를 포함하여 치주염 진행 평가를 위한 추가 기술의 사용이 가능할 수 있습니다. 모델이 인간에서 파킨슨병의 메커니즘이나 원인의 모든 측면을 반영할 수는 없지만, 이 연구는 개입 후 14일에 치주 조직과 치조골의 상당한 퇴행성 및 염증 변화가 유도될 수 있음을 보여주며, 이는 치주 질환에 대한 향후 전임상 예방 또는 치료 연구의 기초를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (개념 증명 전화 2020), Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, ESF 유럽 사회 기금 및 ERDF 유럽 지역 개발 기금 (M.M.B; FI18/00104) 및 Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear(M.M.F.C; FPI/040/2020)을 참조하십시오. 저자는 IdISBa의 실험적 수술 및 플랫폼에서 도움을 준 Anna Tomás 박사와 Maria Tortosa에게 감사드립니다. 마지막으로 CBCT 스캐너에 액세스할 수 있는 ADEMA School of Dentistry에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
References
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