Summary
在这项研究中，通过保留结扎和重复注射源自牙龈卟啉单胞菌的脂多糖的组合，在第上颌磨牙周围超过14天，提出了诱导牙周炎的大鼠模型。结扎和LPS注射技术可有效诱发牙周炎，导致牙槽骨质流失和炎症。
Abstract
牙周炎 （PD） 是一种非常普遍的慢性牙周免疫炎性疾病，会导致牙龈软组织、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨丢失。在这项研究中，描述了一种诱导大鼠PD的简单方法。我们提供了在第一上颌磨牙（M1）周围放置结扎模型的详细说明，以及注射脂多糖（LPS）的组合，这些脂多糖来自M1中腭侧的 牙龈卟啉单胞菌 。牙周炎的诱导维持14天，促进细菌生物膜和炎症的积累。为了验证动物模型，通过牙龈沟液（GCF）中的免疫测定法测定了关键的炎症介质IL-1β，并使用锥形束计算机断层扫描（CBCT）计算了肺泡骨质流失。该技术可有效促进牙龈萎缩，肺泡骨质流失，并在14天后实验程序结束时GCF中IL-1β水平升高。该方法可有效诱导PD，因此能够用于疾病进展机制和未来可能的治疗方法的研究。
Introduction
牙周炎（PD）是全球第六大最普遍的公共卫生疾病，影响约11%的总人口，是一种晚期，不可逆转和破坏性的牙周病形式1，2。PD是一种影响牙龈和牙周组织的炎症过程，导致牙龈萎缩，交界上皮的顶端迁移伴口袋发育，以及牙槽骨的丧失3。此外，PD与几种全身性疾病有关，包括心血管疾病，肥胖症，糖尿病和类风湿性关节炎，环境和宿主特异性因素在其中起重要作用4，5。
因此，PD是一种多因素疾病，主要由微生物斑块的积累（由微生物群落失调引起）和宿主对牙周病原体的过度免疫反应引起，这导致牙周组织分解4，6。在几种牙周细菌中，革兰氏阴性厌氧菌 牙龈卟啉单胞 菌是PD4的关键病原体之一。 牙龈卟啉单胞菌 在其壁中含有复杂的脂多糖（LPS），这种分子已知可诱导发炎的牙周组织中的多形核白细胞浸润和血管扩张7。这导致炎症介质的产生，例如白细胞介素 1 （IL-1）、IL-6 和 IL-8、肿瘤坏死因子 （TNF） 或前列腺素，随后破骨细胞活化和骨吸收，导致组织破坏和最终牙齿脱落3。
动物模型的不同优点包括能够像人类一样模拟细胞复杂性，或者比体外研究更准确， 体外 研究是在细胞类型有限的塑料表面上进行的8。为了在 体内实验模拟PD，已经使用了不同的动物物种，如非人灵长类动物，狗，猪，雪貂，兔子，小鼠和大鼠9。然而，大鼠是研究PD发病机制最广泛的动物模型，因为它们价格低廉且易于处理10。他们的牙龈组织具有与人类牙龈组织相似的结构特征，牙龈沟较浅，交界上皮附着在牙齿表面。此外，与人类一样，交界上皮促进细菌、异物和炎症细胞渗出物的通过 9.
据报道，大鼠PD诱导实验模型之一是在牙齿周围放置结扎，这在技术上具有挑战性但可靠10。结扎位置有利于牙菌斑和细菌积聚，在牙龈沟中产生生态失调，从而导致牙周组织炎症和破坏11。在该大鼠模型中，牙周附着的丧失和肺泡骨的吸收可能在7天内发生8。
PD的另一种动物模型包括将LPS注射到牙龈组织中。结果，骨断裂形成和骨质流失受到刺激。该模型的组织病理学特征与人类建立的PD相似，其特征是更高水平的促炎细胞因子，胶原蛋白降解和肺泡骨吸收6，8。
因此，本研究的目的是描述基于 牙龈卟啉单胞菌-LPS（Pg-LPS）注射技术，结合第一上颌磨牙（M1）周围的结扎放置的实验PD的简单大鼠模型。这是一个与人类PD疾病具有相似特征的模型，可用于研究疾病进展机制和未来可能的治疗方法。
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Protocol
注：该研究的实验方案已获得巴利阿里群岛健康研究所动物实验伦理委员会（CEEA-UIB;参考编号163/03/21）的批准。
1. 动物麻醉和程序准备
- 手术前对所有手术器械（铝制口塞，牙科探索者，金刚石枪，手术剪刀，显微手术钳，微型针架，空背雕刻机，骨膜显微外科电梯和显微外科剪刀）进行消毒（在135°C下5分钟）。
- 在无菌条件下准备手术所需的所有溶液，如下所述：
- 通过将 1.6 mL 氯胺酮与 1 mL 在磷酸盐缓冲溶液 （PBS）/盐水中稀释的甲苯噻嗪混合，制备氯胺酮 （60 mg/mL） 和甲苯噻嗪 （8 mg/mL） 的混合物。将储备液储存在4°C。
- 在PBS/盐水中将阿替美唑稀释至终浓度为0.25mg / mL。将储备液储存在4°C。
- 将丁丙诺啡稀释至PBS/盐水中的终浓度为0.03mg / mL。将储备液储存在4°C。
- 在无菌盐水中制备 1 mL Pg-LPS （1 mg/mL）。将原液储存在-20°C。
- 对于实验，使用雌性和雄性Wistar大鼠，年龄为12周，手术时体重为210-350克。将动物分组饲养在适当的环境和恒定条件下（20-24°C，每天12小时明暗循环），食物和标准水随意提供。
- 为了诱导麻醉，称量大鼠并使用25G无菌皮下注射针和1mL注射器腹膜内（IP）以80/10mg / kg浓度施用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物。
- 大鼠麻醉后，将动物仰卧放在加热的手术平台上;在手术过程中，盖住动物的身体以防止热量散失。
注意：麻醉深度是通过手术过程中踏板反射的丧失和监测生命体征来评估的。如果需要，使用小鼻锥用2%异氟醚在100%氧气中维持麻醉。麻醉诱导后将无菌眼药膏涂抹在双眼上，以保护角膜并防止干燥。 - 在手术过程中，使用小鼻锥给予100%氧气，并通过脉搏血氧仪监测脉搏率和氧饱和度。
注意：如果氧饱和度和脉率分别低于 95% 和 190 bpm，请停止手术并将动物置于侧卧位，直到达到正常值。 - 在门牙（上部和下部）周围使用铝制口塞打开大鼠嘴，用舌头缩回舌头并将上颌骨和下颌骨稳定在开放，舒适的工作位置，从而能够进入下颌磨牙。
注意：如果需要将动物置于侧卧位，请在改变其位置以利于恢复之前取下嘴塞。一旦动物被麻醉，在手术前收集牙龈沟液（GCF）（基础条件下的样本）（第0天）。 - 按以下步骤收集 GCF：
- 将动物仰卧在手术平台上，用铝嘴堵嘴将上颌骨和下颌骨稳定在开放位置。
- 使用总共四个（每个M1两个）吸收纸点nº30（0.03厘米直径x 3厘米长）收集GCF，将其插入M1中腭周围的牙龈缝隙（牙龈上皮和相邻牙釉质之间的空间）直到轻微阻力。将纸点保持在同一位置共 30 秒，然后立即取出。
- 收集后，立即将纸点转移到塑料小瓶中，并储存在-80°C直至测定性能。
2.保留结扎技术和龈内 Pg-LPS 注射
注意：结扎模型是通过使用显微手术器械在牙龈沟内的M1周围双侧放置无菌编织丝结扎（5/0）并用外科医生的结固定在腭表面上来创建的（第0天）。使用的显微手术器械有显微手术钳、微型持针器、空背雕刻机、骨膜显微外科升降机和显微外科剪刀。还使用了带有LED光源的手术放大镜（3.6倍放大倍率）。
- 将缝合线的远端尾部定位在牙列的腭侧，并将近端段插入 M1 和第二上颌磨牙 （M2） 的接触之间。
- 使用骨膜显微外科电梯将缝合线插入沟内。非常小心地将结扎线包裹在M1的颊表面，因为该水平的组织呈现出狭窄的附着牙龈区域。在腭方面，确保缝合线两端收紧，以确保将其打入牙龈沟。
注意：如果在M1和M2之间插入缝合线时观察到阻力，则可以使用牙科探疗师和菱形钻头稍微打开触点。 - 用外科医生的结绑住缝合线的末端，并将尾巴修剪得尽可能短。将结插入沟中。
注意：手术器械的尖端会导致口腔创伤和出血。准备一小段纱布或棉签，从口腔中取出血液，并施加压力以阻止任何出血。采用显微外科手术方法进行仔细的软组织管理可最大程度地减少手术并发症并减少组织创伤。 - 结扎定位后，用 25 G 无菌皮下注射针头和 1 mL 注射器将 40 μL Pg-LPS 注入 M1 中腭侧的龈下组织（牙齿根部或颈部与牙龈边缘之间）（第 0 天）。
3. 程序结束
- 在连接定位和 Pg-LPS应用后，将大鼠从手术状态释放，并将其放置在加热灯下的干净单独的笼子中。
- 用25G无菌皮下注射针头和1mL注射器注射拮抗剂阿替美唑（0.5mg / kg皮下注射（SC））。
- 为了缓解疼痛，注射0.03毫克/公斤丁丙诺啡，SC。
- 监测动物的恢复情况，直到手术效果完全逆转。在恒定条件下（20-24°C，每天12小时光暗循环）将每只大鼠单独饲养在适当的环境中。随意提供食物和去离子水。
- 在手术后的前2天，称量动物并每天两次注射丁丙诺啡SC以缓解疼痛。
注意：丁丙诺啡可以在开始手术之前给药，以消除收尾效应。 - 在实验期间，每周一次或两次通过体重和一般行为评估监测动物。
4. 术后随访
注意：PD的诱导维持14天，以促进细菌生物膜的积累和随后的炎症。必须检查和调整结扎，每周注射三次 Pg-LPS（第2天，第4天，第6天，第8天，第10天和第12天）。
- 检查并调整连字（第 2 天、第 4 天、第 6 天、第 8 天、第 10 天和第 12 天），如下所示：
- 使用麻醉诱导室在100%氧气中用2%异氟醚麻醉。
- 大鼠麻醉后，将动物放在其背上，并在手术过程中使用一个小鼻锥，在100%氧气中加入1%异氟醚以维持动物麻醉。
- 使用门牙（上部和下部）周围的铝制口塞打开大鼠嘴，用舌头缩回舌头并将上颌骨和下颌骨稳定在开放、舒适的工作位置，以便能够进入结扎。
- 在骨膜显微外科电梯的帮助下收紧牙龈上的结扎线，并确保插入结扎线，在牙龈周围产生炎症。
注意：手术后7-10天，结扎可能会丢失。如果发生这种情况，请按照 Pg-LPS注入（步骤2.4）的说明进行操作。
- 结扎调整后，用 25 G 无菌皮下注射针头和 1 mL 注射器将 40 μL Pg-LPS 双侧注射到 M1 中腭侧的龈下组织（第 2 天、第 4 天、第 6 天、第 8 天、第 10 天和第 12 天）。
- 取出鼻锥进行麻醉，并将大鼠放在笼子里。监测动物的恢复，直到麻醉的效果完全逆转。
5. 动物祭祀与分析
注意：评估PD的进展有不同的选择。在这里，所描述的分析包括对牙龈沟液（GCF）促炎细胞因子的评估，以及对牙槽骨损失的评估。
- 在研究的第14天（第14天），在二氧化碳室中用CO2处死动物。对于啮齿动物，建议置换率为腔室体积的 30% 至 70%/分钟。
注意：动物对踏板反射缺乏反应和没有生命体征必须验证以确认安乐死。 - 按以下步骤收集 GCF：
注意：GCF在PD诱导之前（手术前）（第0天）和PD诱导后（处死后）（第14天）收集。- 将动物仰卧在手术平台上，并用铝制嘴塞将上颌骨和下颌骨稳定在开放位置。
- 使用吸附纸点nº30（直径0.03厘米x 3厘米长）收集GCF，将其插入M1中腭周围的牙龈缝隙中，直到轻微阻力。将纸点保持在同一位置共 30 秒，然后立即取出。
- 收集后，立即将纸点转移到塑料小瓶中并储存在-80°C直至测定性能。
- 要评估GCF中的蛋白质，请制备以下溶液并按照所述洗脱方法的步骤进行操作：
注意：根据制造商的方案，使用免疫测定法在GCF（第14天）上评估IL-1β。- 准备新鲜的洗脱缓冲液，并在整个提取过程中将其保持在冰上，以抑制蛋白酶活性。
- 按照如下所述制备洗脱缓冲液所需的所有溶液：
- 在超纯水中制备 1 mL 抑肽酶 （1 mg/mL）。
- 在甲醇中制备 10 mL 苯甲基磺酰氟 （PMSF） （200 mM）。
- 将 125 μL PMSF 和 250 μL 抑肽酶加入 24.5 mL PBS 溶液 （pH = 7.4） 中以制备洗脱缓冲液。
- 将一种商业磷酸酶抑制剂片剂与10mL新鲜制备的洗脱缓冲液溶解10分钟，在4°C下搅拌。
注意：GCF洗脱的持续时间是有限的;在前30分钟内加入磷酸酶抑制剂片剂后立即用于离心。 - 加入磷酸酶抑制剂后，将 11 μL 完全洗脱缓冲液直接加入到带有纸点的试管中。
- 在4°C下以452× g 离心管5分钟。
- 将洗脱的内容物转移到新的塑料小瓶中。再重复此过程四次，以获得 50 μL 的总体积。
- 最后一次离心后，将总体积的60μL直接添加到纸点上，并在4°C下最后一次以452× g 离心5分钟。
- 使用所需的洗脱体积进行蛋白质评估。
- 安乐死和GCF收集后，在手术剪刀的帮助下，切掉大鼠的上颌。尝试剥下大鼠的面具，尽可能少地留下软组织。
- 将下颌放置在显微镜载物台上进行可视化，并以所需的放大倍率拍摄照片。
- 将下颌直接放入用PBS稀释的4%多聚甲醛（PFA）中。每周用新的PFA刷新两次，持续12天，以完全固定。
注意：涉及PFA的步骤应按照安全数据表的建议在通风橱中进行。 - 完全固定颌骨后，使用锥形束计算机断层扫描 （CBCT） 扫描仪评估骨质流失，如下所示：
- 打开电脑。
- 打开 CBCT 分析程序。
- 选择 扫描协议>义齿扫描模式。
- 选择 视场 （FOV） > （ 11x8） HIR（ 90 kV 电压和 3 mA 电流）。
- 将大鼠的固定上颌骨放在龙门架中。
- 单击 下一步。
- 单击X 射线发射按钮 （按下X射线遥控器进行发射，并在整个扫描过程中按住它）。
- 如有必要，通过按下控制按钮将上颌骨重新定位在正面平面的中心，然后单击X 射线发射按钮 （按下X射线遥控器进行发射并在整个扫描过程中按住它）。
- 单击 下一步。
- 单击X 射线发射按钮 （按下X射线遥控器进行发射，并在整个扫描过程中按住它）。
- 如有必要，通过按下控制按钮将假牙重新定位在矢状面的中心，然后单击 X 射线发射按钮 （按下 X 射线遥控器进行发射并在整个扫描过程中按住它）。
- 单击 下一步。
- 单击 “开始”按钮 （按 X 射线遥控器进行发射，并在整个考试期间按住它）。等待直到收到处理消息，然后按照显示的说明进行操作。
- 将出现一个窗口视图。将灰度调节为 65%，然后单击 应用。
- 要保存扫描，请单击“ 文件 ”并将其保存为DICOM格式。然后，单击 “所有图像 ”，在 DICOM 导出选择窗口中，选择显示的所有参数（初始图像、原始轴向、重新格式化的轴向、多平面）并选择预定义类型。
- 使用分析程序处理上颌磨牙的二维和矢状代表图像，如下所示：
- 打开软件。
- 单击“ 文件 并 打开”，然后选择包含 DICOM 格式图像的文件夹，然后单击“ 打开”。
- 等到出现“转换为8位”窗口，选择0到6，000的范围，然后单击 确定。
- 点击 原始图片。
- 定义所选内容的顶部和底部以限制感兴趣区域。搜索出现牙槽骨的第一个和最后一个图像，并使用选择 顶部 和 选择底部 命令选择它。
注意：可以导出臼齿牙槽骨的代表性二维图像，如图 3A，B所示。 - 对于矢状代表图像，请单击切换 配置文件栏。
- 在上颚中间画一条矢状线，然后单击“ 重新切片模型”。确定用于分隔感兴趣区域的参数（切片间距：1;切片数：100），然后单击 “确定”。等到切片模型结束。最后，单击保存 重新切片的图像。
注意：可以输出臼齿牙槽骨的代表性矢状面想象，如图 3C，D所示。
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Representative Results
实验步骤的时间表如图 1所示。 图2A 显示了手术干预后下颌骨的图像，在实验的时间0处在M1的沟周围结扎。 图2B 显示了在手术14天后，M1周围的结扎如何进入牙龈沟，引起牙龈发炎并浸润积聚。
图1：大鼠牙周炎（PD）诱导实验程序时间表的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
具有代表性的二维图像（图3;红色方块）显示基底对照之间的下颌骨槽骨质流失差异，显示更多的骨体积（图3A），而在PD建立后，显示更高的肺泡骨质丢失（图3B）。此外，与基础对照组（图3C）相比，矢状图像的分析突出了PD建立后M1（图3D;红色箭头）和M2（图3D;绿色箭头）的神经根间骨区域的肺泡骨质流失更大。牙槽骨吸收的特征是水泥牙釉质连接处（CEJ）和牙槽骨嵴（ABC）之间的空间增加。两个大鼠组中CEJ和ABC之间的距离如图3C，D所示，带有蓝色箭头。与基础对照（图3C）相比，已建立的PD在CEJ和ABC之间产生了较大的空间（图3D）。
在牺牲的那一刻，腭的图像在不同组中表现出M1牙龈衰退的差异（图4A，B）。与基础对照组（图4A）相比，PD组（图4B）由于骨支撑和根暴露的丧失，显示出更大的顶端牙龈迁移。此外，与基础对照组（图4A）相比，PD组（图4B）表现出更大的上颌磨牙周围牙龈炎症。图4C显示了GCF促炎细胞因子IL-1β的分析结果，显示与对照组相比，PD组中显示的IL-1β释放量显着更高。根据文献，IL-1β参与牙周炎的炎症，免疫调节和骨吸收，是牙周组织破坏的强刺激剂12。
图2：在不同时间插入M1沟中的结扎图像。 （A）大鼠腭，在插入结扎后0天在M1周围放置结扎。（B）在插入结扎后14天在M1周围放置结扎的大鼠腭。 请点击此处查看此图的大图。
图3：牙槽骨和上颌磨牙的代表性二维图像。 通过CBCT获得的（A）基底对照和（B）结扎插入和 Pg-LPS注射建立牙周炎（PD）14天的上颌磨牙牙槽骨（红色方块）的代表性二维照片。（C）基底对照和（D）PD上颌磨牙的代表性矢状二维视图。红色箭头表示M1的神经根间牙槽骨区域，蓝色箭头表示CEJ与ABC之间的距离，绿色箭头表示M2的根间牙槽骨区域。 请点击此处查看此图的大图。
图4：上颚的代表性图像。 牺牲（A）基础对照组和（B）牙周炎（PD）组后腭的代表性图像，用结扎插入和 Pg-LPS注射治疗14天。（C）测定基础对照组和PD组GCF中的IL-1β浓度（n = 9）。数据表示SEM±平均值。 结果由Kruskal-Wallis进行统计比较：* p <0.05 PD组与基础对照组。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该方法描述了 Pg-LPS注射和M1周围结扎放置的组合技术后在大鼠中诱导PD，揭示了该方法后14天内可以诱导牙周组织和牙槽骨的显着变化。
在此过程中，必须注意不同的关键步骤。在动物麻醉和手术准备期间，评估手术过程中的适当麻醉对其成功至关重要，确保动物的正确定位，用门牙周围的铝口堵嘴稳定张开的大鼠嘴，并避免动物被堵嘴和手术器械伤害。如果血氧饱和度和脉搏率下降，应停止手术并将动物置于侧卧位，直到达到正常值。在结扎位置期间，缝合线和结必须正确插入沟中，考虑到应尽量减少软组织损伤以防止其他区域的疼痛和炎症。考虑到有关动物福祉的伦理问题，必须监测动物的恢复情况，直到麻醉效果完全逆转。手术后前2天的止痛药是必不可少的。监测动物的体重和行为也很重要，以评估大鼠对手术的耐受程度，并确保它不会表现出任何极端的痛苦。在注射 Pg-LPS和调整结扎到M1周围的龈下组织的术后方案中，首先，重要的是将结扎收紧并重新定位在顶端位置以产生炎症。其次，重要的是小心地双侧注射 Pg-LPS，以免造成口腔创伤。此外，麻醉动物时必须小心，并应监测直至恢复。在收集GCF期间，校准的纸张应保持在同一位置相同的总时间，并且将其插入中腭M1周围的同一牙龈缝隙中很重要。在GCF洗脱步骤中，重要的是在加入市售磷酸酶抑制剂片剂后立即使用洗脱缓冲液。协议的最后一个关键步骤是在CBCT扫描期间;样品和分析方案的正确对齐对于获得可解释的结果至关重要。
每只动物对Pg-LPS注射的比暴露和M1周围的保留结扎的变化可以作为无法实现正确炎症和随之而来的骨吸收的原因。虽然使用该程序在诱导PD方面取得了良好的结果，但重要的是通过严格遵守方案来密切减少动物之间的变异。该方法最重要的修改之一是将保留结扎放置在M1周围，而不是M2周围，这是文献13，14，15中最传统的结扎模型。在小鼠或大鼠中进行结扎放置的操作程序存在技术困难，并且由于小鼠口腔和牙齿的体积小，对许多研究人员来说是一个潜在的挑战11，16。使用大鼠并将结扎放在M1周围有助于操作和进入该区域，这也减少了动物在手术过程中的压力。在方案期间没有观察到动物痛苦，但如果任何大鼠表现出痛苦的迹象，请考虑将它们从实验中移除以防止痛苦。最后，手术的最大限制步骤是避免结扎的损失，这可能发生在手术后 7-10 天。为了随着时间的推移增加和维持疾病强度，重要的是调整结扎以保持与牙龈组织的亲密接触，减轻动物之间牙周炎诱导强度的变化15。通常，如果程序执行正确，则无需修改，并且将获得一致的结果。
需要注意的是，此模型存在一些限制。首先，开发了一种用于研究由创伤性损伤（结扎位置）引起的PD的技术，该技术被认为有助于细菌的局部积累，从而增强细菌介导的炎症和骨质流失13，10，结合Pg-LPS注射。但是，事实上，该方法并不模仿导致人类牙周炎微生物群失调的自然病因学因素，也没有模仿可能引起牙周炎的其他几种可能机制。此外，鼠牙结构与人类15不同。此外，虽然所提出的方法对研究急性PD有效，但它可能无法反映慢性PD16的长期骨质流失和炎症浸润特征。详细地介绍了用于评估肺泡骨质流失的方法，最常用的骨多维评估方法是显微CT，它可以评估外部因素并提供骨骼的三维图像。此外，可以在不破坏骨骼的情况下分析小梁骨参数、骨体积和骨矿物质密度14，17。然而，这里建议使用CBCT评估肺泡骨质流失（图3）作为显微CT的替代方法;虽然获得较低分辨率的图像，但它也提供了牙周炎进展的有用的定性和定量分析18，19，20。因此，CBCT检查提供了一种准确的成像方法，比显微CT更容易获得和可及，这将有助于研究大鼠牙周炎诱导。
在已用于模拟体内PD以在良好控制的条件下评估牙齿支撑组织（牙龈和骨骼）的各种动物模型中，结扎诱导的PD模型已广泛用于大鼠，狗和非人灵长类动物13。文献还表明，尽管在某些方案中使用，但由于与大鼠相比，小鼠口腔的尺寸相对较小，因此使用小鼠 - 代表了一种方便，廉价和多功能的模型 - 导致了更多的技术挑战13。与其他模型相比，结扎诱导的PD大鼠模型具有几个优点，包括快速疾病诱导，它可以在可预测的时间开始，并在几天内达到肺泡骨质流失的高潮（小鼠和大鼠）13。这种方法还有其他优点，例如研究牙周组织和牙槽骨再生的潜力，以及定位和解剖发炎的牙龈组织以评估炎症水平的能力15。将结扎诱导的PD模型与LPS注射相结合的方法在牙周中增加了局部破坏性炎症反应，从而增强了结扎产生的结缔组织附着和肺泡骨吸收的丧失。这种加性效应建议随着LPS注射的浓度和频率而增加10。这里报道的方法提出了结扎与Pg-LPS注射组合的优化方案，具有两种方法的优点和意义。
优化和开发安全且经济的PD 体内模型 对于促进了解牙周病的发病机制和测试新的治疗方法至关重要。这里介绍的 Pg-LPS注射和M1周围结扎放置的组合技术的PD模型被评估为一个有吸引力的研究模型，用于研究宿主 - 微生物相互作用，牙周炎炎症和牙槽骨吸收。该模型识别协议的最关键集，以基于图像的技术细节描述它们，并标准化和优化这些组合技术的使用。可以使用其他技术来评估牙周炎进展，包括牙槽骨和周围附着的牙龈的组织学分析，确定参与炎症的其他细胞因子以及口腔微生物群的表征。虽然该模型不能反映人类PD机制或原因的所有方面，但本研究表明，干预后14天可以诱导牙周组织和牙槽骨的显着退行性和炎症性变化，为未来的牙周病临床前预防或治疗研究提供基础。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了巴利尔斯大学企业基金会（2020年概念验证电话）的支持，由经济和竞争部卡洛斯三世健康研究所支持，由ESF欧洲社会基金和ERDF欧洲区域发展基金共同资助（与M.M.B;FI18/00104）和调查总局、调查委员会、巴利尔政府（与M.M.F.C;FPI/040/2020）。作者感谢Anna Tomás博士和Maria Tortosa博士在IdISBa实验手术和平台上的帮助。最后，感谢ADEMA牙科学院使用CBCT扫描仪。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adsorbent paper point nº30 | Proclinc | 8187 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| Atipamezole | Dechra | 573751.5 | Revanzol 5 mg/mL |
| Braided silk ligature (5/0) | Laboratorio Arago Sl | 613112 | |
| Buprenorphine | Richter pharma | 578816.6 | Bupaq 0.3 mg/mL |
| Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner | MyRay | hyperion X9 | Model Hyperion X9 |
| CTAn software | SkyScan | Version 1.13.4.0 | |
| Dental explorer | Proclinc | 99743 | |
| Diamond lance-shaped bur | Dentaltix | IT21517 | |
| Food maintenance diet | Sodispain research | ROD14 | |
| Heated surgical platform | PetSavers | ||
| Hollenback carver | Hu-FRIEDY | HF45234 | |
| Hypodermic needle | BD | 300600 | 25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM |
| Isoflurane | Karizoo | Isoflutek 1000mg/g | |
| Ketamine | Dechra | 581140.6 | Anesketin 100 mg/mL |
| Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis | InvivoGen | TLRL-PGLPS | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PB08 | |
| Micro needle holter | Fehling Surgical Instruments | KOT-6 | |
| Microsurgical pliers | KLS Martin | 12-384-06-07 | |
| microsurgical scissors | S&T microsurgical instruments | SDC-15 RV | |
| Monitor iMEC 8 Vet | Mindray | ||
| Multiplex bead immunoassay | Procartaplex, Thermo fisher Scientific | PPX-05 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 8187151000 | |
| Periosteal microsurgical elevator | Dentaltix | CU19112468 | |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Roche | 10837091001 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Commercial phosphatase inhibitor tablet |
| Plastic vial | SPL Lifesciencies | 60015 | 1.5mL |
| Saline | Cinfa | 204024.3 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model SteREO Discovery.V12 | |
| Surgical loupes led light | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Zepf Surgical | 08-1701-17 | |
| Syringe | BD plastipak | 303172 | 1mL |
| Veterinary dental micromotor | Eickemeyer | 174028 | |
| Xylazine | Calier | 20102-003 | Xilagesic 20 mg/mL |
References
- Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
- Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
- Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
- Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
- Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
- Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
- Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
- Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
- Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
- Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
- Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
- Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
- Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).
