Исследование биологии и метаболизма бежевого жира с использованием системы активации CRISPR SunTag-p65-HSF1
Summary
В этом протоколе представлено использование CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) в адипоцитах (AdipoSPH) в качестве альтернативной стратегии аденоассоциированному вирусу (AAV) для исследования биологии бежевого жира. Инъекция in vivo несущей AAV сгРНК, нацеленной на эндогенный ген Prdm16, достаточна для того, чтобы индуцировать развитие бежевого жира и усилить программу термогенных генов.
Abstract
Технология кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) вызвала революцию в биологии, и последние инструменты были применены далеко за пределами первоначально описанного редактирования генов. Система активации CRISPR (CRISPRa) сочетает в себе каталитически неактивный белок Cas9 (dCas9) с различными модулями транскрипции, чтобы индуцировать экспрессию эндогенных генов. SunTag-p65-HSF1 (SPH) — это недавно разработанная технология CRISPRa, которая сочетает в себе компоненты синергетических медиаторов активации (SAM) с активаторами SunTag. Эта система обеспечивает сверхэкспрессию одного или нескольких генов путем разработки индивидуальной однонаправляющей РНК (сгРНК). В этом исследовании ранее разработанная мышь SPH была использована для создания условной мыши, экспрессирующей SPH в адипоцитах (линия адипонектина Cre), названной AdipoSPH. Чтобы индуцировать фенотип жира от белого до бежевого (потемнение), аденоассоциированный вирус (AAV), несущий sgРНК, нацеленный на эндогенный ген Prdm16 (хорошо известный фактор транскрипции, связанный с развитием коричневого и бежевого жира), вводили в паховую белую жировую ткань (iWAT). Эта мышиная модель индуцировала экспрессию эндогенного Prdm16 и активировала термогенную генную программу. Кроме того, in vitro SPH-индуцированная сверхэкспрессия Prdm16 увеличивала потребление кислорода бежевыми адипоцитами, фенокопируя результаты предыдущей модели трансгенной мыши Prdm16. Таким образом, этот протокол описывает универсальную, экономичную и эффективную по времени модель мыши для исследования биологии жировой ткани.
Introduction
Бежевые (или бритовые) адипоциты представляют собой разъединяющие адипоциты, экспрессирующие белок 1 (UCP1), и богатые митохондриями адипоциты, которые находятся в депо белой жировой ткани (WAT). Бежевый жир появляется из подмножества предшественников адипоцитов или зрелых белых адипоцитов в ответ на воздействие холода и других раздражителей 1,2. Бежевые адипоциты могут преобразовывать энергию в тепло UCP1-зависимым или независимым образом3. Независимо от своей термогенной функции, бежевый жир также может улучшить метаболическое здоровье другими средствами, такими как секреция адипокинов и противовоспалительная и антифиброзная активность. Исследования на мышах и людях показали, что индукция бежевого жира улучшает гомеостаз глюкозы и липидов всего тела3. Однако, несмотря на то, что наши знания о биологии бежевого жира быстро развивались в последние годы, большинство его метаболических преимуществ и связанных с ними механизмов до сих пор до конца не изучены.
Кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) были впервые описаны в эукариотических клетках как инструмент, способный генерировать двухцепочечный разрыв (DSB) на определенном участке генома за счет нуклеазной активности белка Cas9 4,5. Cas9 управляется синтетической однонаправляющей РНК (sgRNA) для нацеливания на определенную область генома, что приводит к ДНК DSB. В дополнение к использованию нуклеазы Cas9 для целей редактирования, технология CRISPR-Cas9 эволюционировала, чтобы использоваться в качестве инструмента регуляции генов, специфичного для последовательности6. Разработка каталитически неактивного белка Cas9 (dCas9) и ассоциация транскрипционных модулей, способных усиливать экспрессию генов, привели к появлению инструментов активации CRISPR (CRISPRa). Появилось несколько систем CRISPRa, таких как VP647,8, синергетический медиатор активации (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 и SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, который сочетает в себе компоненты активаторов SAM и SunTag. Недавно было продемонстрировано, что индуцированная экспрессия нейрогенных генов в нейробластах N2a и первичных астроцитах выше при использовании SPH по сравнению с другими системами CRISPRa14, что демонстрирует SPH как перспективный инструмент CRISPRa.
Здесь мы воспользовались ранее разработанной мышью SPH14 для создания условной мышиной модели, экспрессирующей SPH специфически в адипоцитах с использованием линии адипонектина Cre (AdipoSPH). С помощью аденоассоциированного вируса (AAV), несущего гРНК, нацеленную на эндогенный ген Prdm16, было индуцировано потемнение (превращение белого в бежевое) пахового WAT (iWAT) для увеличения экспрессии программы термогенных генов. Кроме того, in vitro сверхэкспрессия Prdm16 усиливает потребление кислорода. Таким образом, этот протокол предоставляет универсальную модель SPH мыши для изучения механизмов развития бежевого жира в жировой ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одним из наиболее полезных нередактируемых применений технологии CRISPR является опрос функции генов путем активации эндогенных генов с использованием систем CRISPRa6. SPH — это мощный CRISPRa, который первоначально был описан как индуцирующий превращение астроцитов в активные ней…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят за поддержку, полученную от Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp для создания мышей AdipoSPH, Лаборатории инммунометаболизма и клеточной сигнализации и Национального института науки и технологий по фотонике, применяемой к клеточной биологии (INFABIC) за всю экспериментальную поддержку. Мы благодарим Исследовательский фонд Сан-Паулу (FAPESP) за финансовую поддержку: 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
References
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
- Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
- Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
- Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
- Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
- Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).
