В этом протоколе представлено использование CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) в адипоцитах (AdipoSPH) в качестве альтернативной стратегии аденоассоциированному вирусу (AAV) для исследования биологии бежевого жира. Инъекция in vivo несущей AAV сгРНК, нацеленной на эндогенный ген Prdm16, достаточна для того, чтобы индуцировать развитие бежевого жира и усилить программу термогенных генов.
Технология кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) вызвала революцию в биологии, и последние инструменты были применены далеко за пределами первоначально описанного редактирования генов. Система активации CRISPR (CRISPRa) сочетает в себе каталитически неактивный белок Cas9 (dCas9) с различными модулями транскрипции, чтобы индуцировать экспрессию эндогенных генов. SunTag-p65-HSF1 (SPH) — это недавно разработанная технология CRISPRa, которая сочетает в себе компоненты синергетических медиаторов активации (SAM) с активаторами SunTag. Эта система обеспечивает сверхэкспрессию одного или нескольких генов путем разработки индивидуальной однонаправляющей РНК (сгРНК). В этом исследовании ранее разработанная мышь SPH была использована для создания условной мыши, экспрессирующей SPH в адипоцитах (линия адипонектина Cre), названной AdipoSPH. Чтобы индуцировать фенотип жира от белого до бежевого (потемнение), аденоассоциированный вирус (AAV), несущий sgРНК, нацеленный на эндогенный ген Prdm16 (хорошо известный фактор транскрипции, связанный с развитием коричневого и бежевого жира), вводили в паховую белую жировую ткань (iWAT). Эта мышиная модель индуцировала экспрессию эндогенного Prdm16 и активировала термогенную генную программу. Кроме того, in vitro SPH-индуцированная сверхэкспрессия Prdm16 увеличивала потребление кислорода бежевыми адипоцитами, фенокопируя результаты предыдущей модели трансгенной мыши Prdm16. Таким образом, этот протокол описывает универсальную, экономичную и эффективную по времени модель мыши для исследования биологии жировой ткани.
Бежевые (или бритовые) адипоциты представляют собой разъединяющие адипоциты, экспрессирующие белок 1 (UCP1), и богатые митохондриями адипоциты, которые находятся в депо белой жировой ткани (WAT). Бежевый жир появляется из подмножества предшественников адипоцитов или зрелых белых адипоцитов в ответ на воздействие холода и других раздражителей 1,2. Бежевые адипоциты могут преобразовывать энергию в тепло UCP1-зависимым или независимым образом3. Независимо от своей термогенной функции, бежевый жир также может улучшить метаболическое здоровье другими средствами, такими как секреция адипокинов и противовоспалительная и антифиброзная активность. Исследования на мышах и людях показали, что индукция бежевого жира улучшает гомеостаз глюкозы и липидов всего тела3. Однако, несмотря на то, что наши знания о биологии бежевого жира быстро развивались в последние годы, большинство его метаболических преимуществ и связанных с ними механизмов до сих пор до конца не изучены.
Кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) были впервые описаны в эукариотических клетках как инструмент, способный генерировать двухцепочечный разрыв (DSB) на определенном участке генома за счет нуклеазной активности белка Cas9 4,5. Cas9 управляется синтетической однонаправляющей РНК (sgRNA) для нацеливания на определенную область генома, что приводит к ДНК DSB. В дополнение к использованию нуклеазы Cas9 для целей редактирования, технология CRISPR-Cas9 эволюционировала, чтобы использоваться в качестве инструмента регуляции генов, специфичного для последовательности6. Разработка каталитически неактивного белка Cas9 (dCas9) и ассоциация транскрипционных модулей, способных усиливать экспрессию генов, привели к появлению инструментов активации CRISPR (CRISPRa). Появилось несколько систем CRISPRa, таких как VP647,8, синергетический медиатор активации (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 и SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, который сочетает в себе компоненты активаторов SAM и SunTag. Недавно было продемонстрировано, что индуцированная экспрессия нейрогенных генов в нейробластах N2a и первичных астроцитах выше при использовании SPH по сравнению с другими системами CRISPRa14, что демонстрирует SPH как перспективный инструмент CRISPRa.
Здесь мы воспользовались ранее разработанной мышью SPH14 для создания условной мышиной модели, экспрессирующей SPH специфически в адипоцитах с использованием линии адипонектина Cre (AdipoSPH). С помощью аденоассоциированного вируса (AAV), несущего гРНК, нацеленную на эндогенный ген Prdm16, было индуцировано потемнение (превращение белого в бежевое) пахового WAT (iWAT) для увеличения экспрессии программы термогенных генов. Кроме того, in vitro сверхэкспрессия Prdm16 усиливает потребление кислорода. Таким образом, этот протокол предоставляет универсальную модель SPH мыши для изучения механизмов развития бежевого жира в жировой ткани.
Одним из наиболее полезных нередактируемых применений технологии CRISPR является опрос функции генов путем активации эндогенных генов с использованием систем CRISPRa6. SPH — это мощный CRISPRa, который первоначально был описан как индуцирующий превращение астроцитов в активные ней…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят за поддержку, полученную от Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp для создания мышей AdipoSPH, Лаборатории инммунометаболизма и клеточной сигнализации и Национального института науки и технологий по фотонике, применяемой к клеточной биологии (INFABIC) за всю экспериментальную поддержку. Мы благодарим Исследовательский фонд Сан-Паулу (FAPESP) за финансовую поддержку: 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |