CRISPR SunTag-p65-HSF1 Aktivasyon Sistemi Kullanılarak Bej Yağ Biyolojisi ve Metabolizmasının İncelenmesi
Summary
Bu protokol, bej yağ biyolojisini araştırmak için adeno ilişkili virüse (AAV) alternatif bir strateji olarak adipositlerde (AdipoSPH) CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) kullanımını sunmaktadır. Endojen Prdm16 genini hedef alan AAV taşıyan sgRNA’nın in vivo enjeksiyonu, bej yağ gelişimini indüklemek ve termojenik gen programını geliştirmek için yeterlidir.
Abstract
Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) teknolojisi biyolojide bir devrim yarattı ve yeni araçlar orijinal olarak tarif edilen gen düzenlemesinin çok ötesinde uygulandı. CRISPR aktivasyonu (CRISPRa) sistemi, endojen gen ekspresyonunu indüklemek için katalitik olarak inaktif Cas9 (dCas9) proteinini farklı transkripsiyon modülleri ile birleştirir. SunTag-p65-HSF1 (SPH), sinerjik aktivasyon mediatörlerinin (SAM) bileşenlerini SunTag aktivatörleri ile birleştiren yakın zamanda geliştirilmiş bir CRISPRa teknolojisidir. Bu sistem, özelleştirilmiş bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) tasarlayarak tek veya çoklu genlerin aşırı ekspresyonuna izin verir. Bu çalışmada, AdipoSPH adı verilen adipositlerde (adiponektin Cre soyundan) SPH eksprese eden koşullu bir fare oluşturmak için daha önce geliştirilmiş bir SPH faresi kullanılmıştır. Beyaz-bej yağ (kahverengileşme) fenotipini indüklemek için, endojen Prdm16 genini (kahverengi ve bej yağ gelişimi ile ilgili iyi kurulmuş bir transkripsiyon faktörü) hedef alan sgRNA taşıyan adeno ilişkili bir virüs (AAV), inguinal beyaz yağ dokusuna (iWAT) enjekte edildi. Bu fare modeli, endojen Prdm16 ekspresyonunu indükledi ve termojenik gen programını aktive etti. Ayrıca, in vitro SPH kaynaklı Prdm16 aşırı ekspresyonu, bej adipositlerin oksijen tüketimini arttırdı ve önceki bir Prdm16 transgenik fare modelinin sonuçlarını fenotopkopyaladı. Bu nedenle, bu protokol yağ dokusu biyolojisini araştırmak için çok yönlü, uygun maliyetli ve zaman etkili bir fare modelini tanımlar.
Introduction
Bej (veya brite) adipositler, beyaz yağ dokusu (WAT) depolarında bulunan protein 1 (UCP1) eksprese edici ve mitokondriyal bakımından zengin adipositleri ayırır. Bej yağ, soğuğa maruz kalma ve diğer uyaranlara yanıt olarak adiposit progenitörlerinin veya olgun beyaz adipositlerin bir alt kümesinden ortaya çıkar 1,2. Bej adipositler, enerjiyi UCP1’e bağımlı veya bağımsız bir şekilde ısıya dönüştürebilir3. Termojenik işlevinden bağımsız olarak, bej yağ, adipokinlerin salgılanması ve anti-enflamatuar ve anti-fibrotik aktiviteler gibi diğer yollarla metabolik sağlığı da iyileştirebilir. Farelerde ve insanlarda yapılan çalışmalar, bej yağın indüksiyonunun tüm vücut glikozunu ve lipit homeostazını iyileştirdiğini göstermiştir3. Bununla birlikte, bej yağ biyolojisi hakkındaki bilgimiz son yıllarda hızla gelişmesine rağmen, metabolik faydalarının çoğu ve ilgili mekanizmaları hala tam olarak anlaşılamamıştır.
Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) ilk olarak ökaryotik hücrelerde, Cas9 proteini 4,5’in nükleaz aktivitesi yoluyla genomdaki belirli bir bölgede çift iplikçik kırılması (DSB) üretebilen bir araç olarak tanımlanmıştır. Cas9, belirli bir genomik bölgeyi hedeflemek için sentetik bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) tarafından yönlendirilir ve bir DNA DSB’ye yol açar. Nükleaz Cas9’u düzenleme amacıyla kullanmanın yanı sıra, CRISPR-Cas9 teknolojisi, diziye özgü bir gen düzenleme aracı6 olarak kullanılmak üzere gelişmiştir. Katalitik olarak inaktif bir Cas9 proteininin (dCas9) geliştirilmesi ve gen ekspresyonunu artırabilen transkripsiyonel modüllerin ilişkisi, CRISPR aktivasyonu (CRISPRa) araçlarına yol açmıştır. SAM ve SunTag aktivatörlerinin bileşenlerini birleştiren VP647,8, sinerjik aktivasyon aracısı (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 ve SunTag-p65-HSF1 (SPH)14 gibi çeşitli CRISPRa sistemleri ortaya çıkmıştır. Son zamanlarda, N2a nöroblastlarında ve primer astrositlerde nörojenik genlerin indüklenmiş ekspresyonunun, diğer CRISPRa sistemlerine kıyasla SPH kullanılarak daha yüksek olduğu gösterilmiştir14, SPH’yi umut verici bir CRISPRa aracı olarak göstermektedir.
Burada, adiponektin Cre soyunu (AdipoSPH) kullanarak SPH’yi özellikle adipositlerde ifade eden koşullu bir fare modeli oluşturmak için daha önce geliştirilmiş bir SPH fare14’ten yararlandık. Endojen Prdm16 genini hedef alan gRNA’yı taşıyan adeno ilişkili bir virüs (AAV) kullanılarak, termojenik gen programının ekspresyonunu arttırmak için inguinal WAT’ın (iWAT) kahverengileşmesi (beyazdan bej dönüşümüne) indüklendi. Ayrıca, in vitro Prdm16 aşırı ekspresyonu oksijen tüketimini arttırdı. Bu nedenle, bu protokol yağ dokusunda bej yağ gelişimi mekanizmalarını keşfetmek için çok yönlü bir SPH fare modeli sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR teknolojisinin en kullanışlı düzenleme dışı uygulamalarından biri, CRISPRa sistemleri6 kullanılarak endojen genlerin aktivasyonu yoluyla gen fonksiyonunun sorgulanmasıdır. SPH, başlangıçta birkaç nörojenik geni hedef alarak astrositlerin aktif nöronlara dönüşümünü indüklediği açıklanan güçlü bir CRISPRa’dır14. Bu çalışmada, AdipoSPH’nin adipositlerde endojen Prdm16 ekspresyonunu aktive ederek bej yağ biyolojisini araştırmak için …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp’tan AdipoSPH farelerinin üretimi için aldıkları destek, Inmmunometabolizma ve Hücre Sinyalizasyon Laboratuvarı ve Hücre Biyolojisine Uygulanan Fotonik Ulusal Bilim ve Teknoloji Enstitüsü’ne (INFABIC) tüm deneysel destek için teşekkür eder. Sao Paulo Araştırma Vakfı’nın (FAPESP) finansal desteğine teşekkür ederiz: 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
References
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
- Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
- Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
- Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
- Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
- Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).
