Summary
비강 상피는 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 장벽 부위입니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 시스템에서 인간 코로나바이러스-숙주 상호 작용을 특성화하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 성장한 일차 비강 상피 세포를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.
Abstract
SARS-CoV(2002년), MERS-CoV(2012년), SARS-CoV-2(2019년)의 세 가지 고병원성 인간 코로나바이러스(HCoV)가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중 보건 위기를 초래했습니다. 매년 4개의 추가 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)가 일반적인 감기 사례의 상당 부분을 유발하며, 이는 생리학적으로 관련된 시스템에서 이러한 바이러스를 연구하는 것의 중요성을 강조합니다. HCoV는 호흡기로 들어가 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 부위인 비강 상피에 감염을 일으킵니다. 당사는 환자 유래 비강 샘플이 공기-액체 계면(ALI)에서 배양되는 1차 비강 상피 배양 시스템을 사용하여 이 중요한 감시 부위에서 숙주-병원체 상호 작용을 연구합니다. 이러한 배양은 존재하는 세포 유형, 섬모 기능 및 점액 생성을 포함하여 생체 내 기도의 많은 특징을 요약합니다. 치사량과 계절성 HCoV를 비교한 최근 연구를 예시1로 사용하여 HCoV 감염 후 비강 ALI 배양에서 바이러스 복제, 숙주 세포 영양성, 바이러스 유도 세포 독성 및 선천성 면역 유도를 특성화하는 방법을 설명합니다. 코에서 숙주-병원체 상호 작용에 대한 이해가 높아짐에 따라 HCoV 및 향후 등장할 가능성이 있는 기타 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 치료제의 새로운 표적을 제공할 수 있습니다.
Introduction
현재까지 7종의 인간 코로나바이러스(HCoV)가 확인되었으며 다양한 호흡기 질환을 유발합니다2. 일반적인 또는 계절성 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)는 일반적으로 상기도 병리와 관련이 있으며 매년 일반적인 감기 사례의 약 10%-30%를 유발합니다. 이는 일반적인 HCoV와 관련된 전형적인 임상 표현형이지만, 이러한 바이러스는 어린이, 노인 및 면역 저하자를 포함한 위험에 처한 인구 집단에서 더 심각한 하기도 질환을 유발할 수 있습니다 3,4. 중증급성호흡기증후군(SARS)-CoV, 중동호흡기증후군(MERS)-CoV, SARS-CoV-2 등 3가지 병원성 HCoV가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중보건 비상사태를 일으켰습니다. 치명적 HCoV는 더 심각한 호흡기 병리와 관련이 있으며, 이는 MERS-CoV 사례와 관련된 >34%의 치사율(2012년 출현 이후 2,500건 이상의 사례에서 894명 사망)5,6으로 명확하게 설명됩니다. 또한 현재 진행 중인 COVID-19 팬데믹에서 볼 수 있듯이 치명적인 HCoV는 무증상 감염에서 치명적인 폐렴에 이르기까지 다양한 호흡기 질환을 유발한다는 점에 유의해야 합니다7.
HCoV는 다른 호흡기 병원체와 마찬가지로 호흡기로 들어가 비강 상피에 생산적인 감염을 일으킨다8. 하기도로의 전이는 구강/비강에서 폐로의 흡인과 관련이 있는 것으로 생각되며, 여기서 HCoV는 더 심각한 하기도 병리를 유발한다 9,10,11. 따라서, 코는 바이러스 진입을 위한 초기 관문 역할을 하며, 강력한 점액섬모 제거 기계와 하부 기도로의 바이러스 확산을 막기 위한 독특한 선천성 면역 기전을 통해 감염에 대한 주요 장벽이 된다12,13. 예를 들어, 비강 상피세포는 항바이러스 인터페론 및 인터페론 자극 유전자의 평균 기초 수준보다 높은 발현을 하는 것으로 보고되었으며, 이는 비강 세포가 호흡기 바이러스에 대한 조기 반응을 위해 준비될 수 있음을 나타냅니다14,15,16.
우리는 이전에 HCoV 감염이 시작되는 코에서 HCoV-숙주 상호 작용을 모델링하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI)에서 성장한 환자 유래 일차 비강 상피 세포를 활용했습니다. 비강 ALI 배양은 병원성(SARS-CoV-2 및 MERS-CoV)과 일반적인 HCoV(HCoV-NL63 및 HCoV-229E) 모두에 허용되며 A549(폐 선암 세포주)16,17와 같은 기존 기도 상피 세포주에 비해 다양한 이점을 제공합니다. 분화 후, 비강 ALI 배양물은 이질적인 세포 집단을 포함하며, 점액섬모 청소 기계(mucociliary clearance mechanism)와 같은 생체 내 비강 상피에서 기대되는 많은 기능을 나타낸다18. 또한 비강 세포는 하부 기도 배양 시스템(예: 인간 기관지 상피 세포, HBEC)에 비해 이점을 제공하는데, 이는 세포학적 칫솔질을 통한 비강 상피 세포 획득이 HBECs 19,20,21을 얻기 위해 기관지 내시경과 같은 기술을 사용하는 것에 비해 훨씬 덜 침습적이기 때문입니다.
이 논문은 이 비강 ALI 배양 시스템을 활용하여 비강 상피에서 HCoV-숙주 상호작용을 특성화하는 방법을 설명합니다. SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 및 HCoV-229E를 비교하기 위해 최근 발표된 연구에서 이러한 방법을 적용했습니다 1,16,17. 이러한 방법과 대표적인 결과는 이 비강 세포 모델에서 HCoV에 대한 연구를 강조하지만, 이 시스템은 다른 HCoV 및 기타 호흡기 병원체에 매우 잘 적응합니다. 또한, 이러한 방법은 바이러스 복제 및 세포 영양성뿐만 아니라 감염 후 세포 독성 및 선천성 면역 유도를 조사하기 위해 다른 ALI 배양 시스템에 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.
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Protocol
비강 검체의 사용은 펜실베니아 대학교 기관 검토 위원회(프로토콜 # 800614) 및 필라델피아 VA 기관 검토 위원회(프로토콜 # 00781)의 승인을 받았습니다.
1. 비강 ALI 배양 감염
참고: 임상 검체의 획득과 비강 ALI 배양의 성장 및 분화는 이 논문의 범위를 벗어납니다. 일차 비강 상피 세포를 배양하기 위한 구체적인 방법은 이러한 배양물을 이용하여 최근에 발표된 연구에서 찾을 수 있다 18,22,23. 아래 프로토콜은 원하는 경우 상업적으로 이용 가능한 비강 상피 ALI 배양에 추가로 적용할 수 있습니다. 아래에 자세히 설명된 프로토콜과 용량은 24웰 플레이트 트랜스웰 인서트(직경 6.5mm, 멤브레인 표면적 0.33cm2)에 적용할 수 있습니다. 더 큰 트랜스웰(즉, 12웰 플레이트, 직경 12mm, 표면적 1.12cm2)에서 성장한 ALI 배양액을 사용하는 경우 트랜스웰 크기를 반영하도록 부피를 비례적으로 조정합니다.
- 감염 전날:
- 인산염 완충 식염수(PBS)로 ALI 배양액을 3배 세척합니다(~200μL의 데워진 PBS를 추가하고 37°C 인큐베이터에 5분 동안 넣고 PBS를 흡입하고 반복).
- 기초 배지(500μL)를 교체합니다.
- 하룻밤 동안 감염이 수행될 온도에서 배양액이 평형을 이루도록 합니다(즉, 33°C에서 감염하는 경우 PBS 세척 후 배양액을 33°C 인큐베이터에 넣음).
참고: HCoV-229E 및 HCoV-NL63과 같은 감기와 관련된 HCoV는 33°C에서 더 효율적으로 복제되는 것으로 보고되었습니다. 또한 생체 내 비강 상피의 온도는 33°C입니다(이는 폐의 온도인 37°C와 다릅니다).
- 혈청이 없는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 필요에 따라 바이러스를 희석하여 총 접종 용량 50μL에서 원하는 감염 다중성(MOI)을 달성합니다.
참고: 감염은 일반적으로 MOI = 5(높은 MOI)에서 수행되었습니다. 그러나 MOI = 0.5(낮은 MOI)의 감염은 SARS-CoV-2 및 일반적인 감기 관련 HCoV에도 사용되었으며, 이로 인해 유사한 피크 바이러스 역가가 발생하지만 다양한 역학(MOI 중 하나가 허용됨)이 있습니다. - 접종물을 정점으로 추가하고 배양액을 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 감염 시 15분마다 판을 부드럽게 돌립니다(양손으로 판을 단단히 잡고 앞뒤로 좌우로 흔들어 바이러스 접종물의 균일한 흡착을 보장함).
- 1시간 배양 후 바이러스 접종물을 흡인하고 감염된 각 배양액을 PBS로 3회 세척하여 바이러스 접종물을 제거합니다(세척할 때마다 PBS 200μL를 추가하고 5분 동안 배양한 후 피펫으로 흡인 또는 제거).
- 원하는 경우 세 번째 PBS 세척을 수집하여 입력 바이러스가 적절하게 제거되었는지 확인합니다.
- 감염 기간 동안 72시간마다 감염된 ALI의 기초 배지를 새 배지로 교체합니다.
2. 정점 표면 액체(ASL) 수집 및 유출된 바이러스 적정
- 감염 후 미리 결정된 시점에 200μL의 PBS를 감염된 각 트랜스웰의 정점 챔버에 추가합니다.
참고: 관련 시점은 관심 HCoV에 따라 다르며 감염 후 24시간에서 192시간 사이입니다(다양한 HCoV에 대한 바이러스 복제 데이터는 대표 결과 섹션 참조). - PBS를 위아래로 5배 피펫팅하여 정점으로 흘린 바이러스를 최대한 수집하고 전체 부피를 마이크로 원심분리 튜브(ASL 샘플)에 수집합니다.
참고: ASL에는 ALI 배양액에서 분비되는 점액 및 기타 산물 외에도 흘린 바이러스 입자가 포함됩니다. - 표준 바이러스 플라크 분석(바이러스 입자의 농도를 정량화하기 위해 바이러스 함유 샘플을 연속적으로 희석)을 통해 ASL에서 감염성 바이러스를 정량화합니다.
참고: 플라크 분석에 사용되는 세포 유형 및 잠복기는 사용된 바이러스에 따라 다릅니다: SARS-CoV-2(VeroE6 세포); MERS-CoV(VeroCCL81 세포); HCoV-NL63(LLC-MK2 세포); HCoV-229E(Huh7 세포). 바이러스 플라크 분석을 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 이 원고의 범위를 벗어나지만 이전에 Journal of Visualized Experiments(JoVE) 간행물24에 자세히 설명되어 있습니다. - 원하는 경우 감염 후 여러 번 기저 배지를 수집하여 기저 방출 바이러스가 없는지 확인합니다. HCoV는 일반적으로 비강 상피 세포에서 정점으로 방출되지만 희석되지 않은 기저 배지의 플라크 분석을 통해 이를 확인합니다.
- 채취 당일에 플라크 분석에 의한 정량이 발생하지 않는 경우 ASL 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.
3. 세포내 바이러스 정량
- ASL 검체를 채취한 후 각 트랜스웰을 2% 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 500μL의 DMEM이 사전 로드된 깨끗한 24웰 플레이트로 옮깁니다.
참고: FBS가 2% 함유된 DMEM은 후속 동결-해동 주기 동안 바이러스를 안정화하는 데 사용됩니다. - 각 트랜스웰을 PBS로 3번 정진맥으로 세척하여 정맥으로 흘린 바이러스를 완전히 제거합니다.
- 최종 PBS 세척을 제거하기 위해 흡인 한 후 2% FBS가 포함된 DMEM 100μL를 정점 구획에 추가합니다.
- 정점 및 기저 배지가 모두 있는 트랜스웰이 포함된 플레이트를 -80°C 냉동고로 옮기고 3회 연속 동결-해동 주기를 완료하여 세포를 용해합니다.
- 최종 동결-해동 사이클 후 정점(100μL)과 기저(500μL) 배지를 깨끗한 튜브에 넣습니다.
- 500× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.
- 상층액을 수집합니다. 이것은 표준 플라크 분석을 통한 적정을 위한 세포 내 바이러스 샘플입니다.
참고: ASL 수집과 관련하여 수집 과정에서 3중 희석이 발생합니다. ASL 샘플은 200μL의 PBS에서 수집되는 반면, 세포 내 바이러스 샘플은 총 600μL로 수집됩니다.
4. 경상피 전기 저항(TEER) 측정
알림: TEER 측정의 경우 칼슘과 마그네슘이 보충된 PBS(PBS + Ca 2+/Mg2+)를 사용해야 합니다. 옴 단위로 읽도록 설정된 상피 전압/저항계가 사용됩니다(재료 표 참조).
- 제조업체의 지침에 따라 EVOM 기기를 청소, 평형 및 비우십시오. 블랭킹을 위해 비강 세포가 추가되지 않은 "비어있는" 트랜스웰을 사용하십시오. 빈 TEER 측정을 기록합니다.
알림: 여러 바이러스를 사용하는 경우 교차 오염을 방지하기 위해 조건 사이에 EVOM 기기를 엄격하게 세척해야 합니다(70% 에탄올로 세척한 후 탈이온수로 세척하면 충분함). - 감염된 각 트랜스웰을 500μL의 PBS + Ca 2+/Mg 2+ 기저가 있는 사전 라벨이 부착된 깨끗한24 웰 플레이트로 이동하여 트랜스웰에서 잔류 기저 배지를 세척합니다.
- 200μL의 PBS + Ca 2+/Mg2+를 각 트랜스웰의 정점 구획에 추가합니다.
- 1mL의 PBS + Ca 2+/Mg2+를 Endohm-6 측정 챔버에 추가합니다.
- 각 트랜스웰을 Endohm-6 측정 챔버로 이동하고 정점 전극이 정점 구획의 PBS 200μL에 놓이도록 챔버의 뚜껑을 교체합니다. 기저 전극은 Endohm-6 챔버의 바닥에 내장되어 있습니다.
- EVOM 판독값이 안정화되도록 하고 원시 TEER 측정을 기록합니다.
- 적정이 필요한 경우 TEER 측정을 수행한 후 위에서 설명한 대로 ASL 샘플을 수집합니다(TEER 측정을 위해 추가된 PBS + Ca 2+/Mg 2+의200μL에서 수집).
참고: ASL 샘플 수집은 상피 장벽에 미세 파열을 유도하여 TEER 판독값을 혼동할 수 있으므로 TEER 측정 후 ASL을 수집해야 합니다. 또한 기저 매체는 TEER 값에도 영향을 미칠 수 있으므로 TEER 판독 직전에 변경해서는 안 됩니다. - 원시 TEER 판독값을 Ohms/cm2 단위의 최종 측정값으로 변환하려면 빈 TEER 값을 빼고 방정식 (1)을 사용하여 이 값에 트랜스웰 멤브레인의 표면적을 곱합니다.
TEER = [TEER 판독값 - 공백 TEER 값] ×(트랜스웰의 표면적) (1) - HCoV의 경우 감염 후 24시간 또는 48시간마다 TEER을 평가합니다. TEER 변화의 동역학은 바이러스에 따라 달라지는 경우가 많으며 다양한 시점에서 문제 해결이 필요합니다.
- TEER을 측정할 때는 항상 모의 감염 배양을 포함하고 각 시점(음성 대조군)에서 평가합니다.
참고: 모의 배양의 경우 TEER 측정은 안정적으로 유지되거나 배양 분화가 완료된 후 기준선에서 약간 증가할 수 있습니다. 멤브레인 지지대의 표면적은 트랜스웰의 크기와 제조업체에 따라 달라집니다. 24웰 트랜스웰의 표면적은 일반적으로 0.33cm2입니다.
5. 젖산 탈수소효소(LDH) 분석을 통한 감염 중 세포독성 측정
참고: 이 연구에서는 ASL 샘플의 LDH 함량을 시판되는 세포독성 검출 키트를 사용하여 정량화했습니다. 기초 배지의 LDH 신호는 종종 검출 한계 미만이었고 HCoV 감염 배양의 ASL 샘플에서 정량화된 LDH보다 재현성이 떨어지는 경우가 많았습니다.
- LDH 분석에 필요한 추가 대조군을 준비합니다.
- 배경 제어: PBS를 사용합니다(ASL 샘플이 이러한 방식으로 수집된 경우 칼슘과 마그네슘이 포함된 PBS 사용).
- 양성 대조군(한계값): Triton X-100으로 ALI를 정점으로 처리합니다. Triton 대조군을 수집합니다(일반적으로 각 시점에서 3개의 ALI 배양을 사용합니다).
- PBS의 2% Triton X-100 200μL 200을 트랜스웰의 정점 구획에 직접 추가합니다.
- 세포가 완전히 용해될 수 있도록 10-15분 동안 배양합니다.
- 전체 부피를 Triton 천장 샘플로 수집합니다.
- 음성 대조군(낮은 대조군/기준선 LDH 방출): 감염된 배양물과 동일한 공여체에서 유래한 모의 감염 ALI 배양물에서 ASL을 수집합니다.
- 위의 ASL 수집 절차에 따라 음성 대조군 모의 ASL을 수집합니다.
알림: 모든 시점에 대해 이 네거티브 컨트롤에 동일한 트랜스웰을 사용할 수 있는 반면, Triton 컨트롤의 경우 각 시점에 대해 새로운 트랜스웰이 필요합니다.
- 위의 ASL 수집 절차에 따라 음성 대조군 모의 ASL을 수집합니다.
- 각 ASL 샘플의 LDH 판독값과 함께 흘린 바이러스를 정량화하려면 다음과 같이 광학적으로 투명한 평평한 바닥의 검은색 96웰 플레이트를 로드합니다.
- 45μL의 샘플과 55μL의 PBS(총 부피 100μL)를 사용하여 모든 샘플을 PBS로 희석합니다.
- Triton 양성 대조군과 모의 배경 대조군 표본을 동일한 방식으로 처리합니다.
참고: 이 희석을 통해 각 실험 샘플(45μL x 3)을 3배로 로딩하고 플라크 분석을 통한 적정을 위한 충분한 잔류 ASL 부피를 얻을 수 있습니다. - LDH 플레이트를 세 번 로드: Triton 천장, 모의 배경 제어, PBS 제어 및 실험 샘플.
- 제조업체가 표시한대로 반응 혼합물을 준비합니다 (염료 용액 + 촉매).
- 각 웰에 100μL의 반응 혼합물을 첨가하고 빛으로부터 보호된 상태에서 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 20분 후 492nm에서 흡광도를 측정합니다.
- 방정식 (2)를 사용하여 Triton 천장 값에 상대적인 세포 독성 백분율을 계산합니다.
세포 독성 (%)
(2)
(2)6. 면역형광(IF) 이미징을 위한 비강 ALI 배양 준비
- 트랜스웰을 새 24웰 플레이트로 옮기고 PBS로 정점으로 3회 세척합니다(역가가 있는 경우 첫 번째 PBS 세척을 ASL로 수집한 다음 두 번의 추가 PBS 세척을 수행하여 IF 품질을 저해할 수 있는 과도한 흘린 바이러스를 제거)
- 최종 PBS 세척 후 트랜스웰을 정점과 기초 방향으로 4% PFA로 덮습니다.
- 30분 동안 배양하여 4% PFA로 고정한 다음 제거하고 PBS로 3번 세척합니다.
- 날카로운 면도날이나 가위를 사용하여 세포가 들어 있는 트랜스웰 지지대를 절제합니다.
- 각 트랜스웰에 대한 IF 표적 수를 늘리려면 각 멤브레인을 반으로 자르고 각 절반을 서로 다른 항체 조합으로 염색합니다.
- PBS에서 0.2% Triton X-100으로 10분 동안 투과시킵니다.
- PBST(PBS + 0.2% Triton X-100)의 10% 정상 당나귀 혈청과 1% BSA로 실온에서 60분 동안 차단합니다.
알림: 이 단계부터 빛에 노출되지 않도록 샘플을 보호하십시오. - 4°C에서 1차 항체 용액에서 밤새 배양합니다. 모든 항체를 차단 완충액에 1:1,000으로 희석합니다.
참고: HCoV 뉴클레오캡시드 염색을 위한 대표적인 항체와 상피 세포 유형 마커 및 세포골격 염색은 아래에 나열되어 있습니다(제조업체 정보 및 카탈로그 번호는 재료 표 참조).- HCoV 항원 염색의 경우 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드, MERS-CoV 뉴클레오캡시드 및 HCoV-NL63 뉴클레오캡시드를 표적으로 하는 항체를 사용합니다.
- 상피 세포 유형을 식별하려면 잔 세포 마커 MUC5AC 및 섬모 세포 마커 유형 IV β-튜불린을 표적으로 하는 항체를 사용합니다.
- 세포골격 마커의 경우 팔로이딘(F-액틴과 결합)에 대한 항체와 상피 세포 접착 마커인 EpCAM(CD326)을 사용합니다.
- 실온에서 60분 동안 2차 항체 용액에서 배양합니다. 차단 완충액에 1:1,000으로 희석된 2차 항체 염료를 사용합니다.
- 염색이 완료되면 멤브레인을 주걱으로 유리 슬라이드에 옮기고 정점 쪽이 슬라이드를 향하도록 트랜스웰을 향하게 한 다음 장착 용액을 추가합니다. 가장자리 주위에 투명한 매니큐어를 바르기 전에 15-30분 동안 그대로 두십시오.
- 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지 획득(Z축 단계: 0.5μm, 순차 스캐닝)1,16,17.
참고: 배양액을 4% PFA에 고정하고 PBS로 세척한 후 고정 배양액을 4°C에서 몇 주에서 몇 달 동안 보관한 후 염색 및 이미징 준비를 할 수 있습니다. 멤브레인을 염색하고 장착한 후 시료는 어두운 곳에서 4°C에서 장기간(>2년) 보관할 수 있습니다.
7. 서양 면역블로팅을 위한 세포 내 단백질 수집 또는 RT-qPCR 분석을 위한 RNA
- 바이러스 역가를 정량화하는 경우 위에서 설명한 대로 ASL을 수집합니다(프로토콜 섹션 2).
- 멤브레인을 긁으면 인서트가 파손될 수 있으므로 트랜스웰을 깨끗한 24웰 플레이트로 옮깁니다.
- 웨스턴 블롯 분석의 경우, 프로테아제 억제제 및 인산가수분해효소 억제제가 보충된 125μL의 RIPA 완충액(50mM Tris, pH 8, 150mM NaCl, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 1% NP40)에서 총 단백질 용해물을 수집합니다.
- 125 μL의 RIPA 완충액을 정점 격실에 추가하고 5-10분 동안 배양합니다.
- P200 피펫 팁을 사용하여 멤브레인을 긁어 부착된 나머지 세포를 제거하고 전체 부피를 수집합니다(멤브레인의 전체 표면을 세게 긁은 다음 위아래로 여러 번 피펫팅하여 전체 샘플을 수집).
- 단백질 용해물 시료를 얼음 위에서 10분 동안 배양한 다음 4°C에서 10분 동안 최대 속도(20,000 × g)로 원심분리합니다.
- 상층액을 4x Laemmli 샘플 버퍼와 β-메르캅토에탄올(환원제)과 제조업체 프로토콜에 따라 혼합합니다.
- 단백질 샘플을 95°C에서 5분 동안 끓인 다음 전통적인 웨스턴 블로팅 프로토콜 1,16,17을 사용하여 실행합니다.
- 전체 RNA를 수집하려면 시중에서 판매되는 RNA 추출 키트를 선택하십시오.
참고: 24웰 트랜스웰 인서트의 정점 격실은 최대 부피가 ~200μL입니다. 따라서 총 권장 용량에 도달하기 위해 각 배양액에 대해 두 번의 순차적 세척을 수행합니다. 아래 세부 정보는 총 부피 350μL의 RNA 샘플의 권장 수집에 해당합니다. - 200μL의 용해 완충액을 감염된 트랜스웰의 정점 구획에 추가합니다.
- 5-10분 동안 그대로 두었다가 피펫 팁을 사용하여 멤브레인에 남아 있는 세포를 긁어내고 전체 부피를 라벨이 부착된 마이크로 원심분리기 튜브에 모읍니다.
- 150μL의 추가 용해 완충액을 트랜스웰의 정점 구획에 추가하고 동일한 마이크로 원심분리기 튜브에 수집하기 전에 위아래로 피펫팅합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA를 추출합니다.
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Representative Results
대표적인 수치는 원고 Otter et al.1에서 찾을 수 있는 데이터에서 부분적으로 각색되었습니다. 4명 또는 6명의 기증자로부터 유래한 비강 ALI 배양은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 4가지 HCoV(SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 및 HCoV-229E) 중 하나에 감염되었으며, 각 바이러스에 대한 평균 정점 탈락 바이러스 역가는 그림 1A에 나와 있습니다. 이 4가지 HCoV는 모두 비강 ALI 배양에서 생산적으로 복제되지만 SARS-CoV-2 및 HCoV-229E가 가장 효율적으로 복제됩니다. 이는 평균적인 바이러스 역가이며, 개별 기증자의 각 HCoV에 대한 역가가 최근에 발표되었다는 점에 유의하십시오1. 프로토콜 섹션 3에 설명된 대로 비강 ALI 배양을 세척한 후 정점 표면 액체(ASL)의 MERS-CoV 역가를 그림 1B의 세포 내 바이러스 역가와 비교합니다. MERS-CoV 세포 내 역가와 정점 배출 바이러스 역가는 감염 후 48시간(hpi)에 거의 동일합니다.
감염된 비강 ALI 배양물의 면역형광 이미징은 세포 영양성 및 세포융합 형성, 세포 간 융합 및 상피 장벽 무결성 손상과 같은 기타 감염 매개변수를 조사하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 바이러스 항원에 특이적인 항체(예: 뉴클레오캡시드 또는 HCoV 비구조 단백질) 및 섬모 또는 잔 세포에 대한 마커(각각 IV형 β-튜불린 및 MUC5AC)와 감염된 배양물의 동시 염색은 비강 ALI에서 HCoV에 대한 세포 영양성을 측정할 수 있습니다25,26. 그림 2A는 SARS-CoV-2, MERS-CoV 및 HCoV-NL63에 감염된 비강 배양의 대표적인 이미지를 보여줍니다.
SARS-CoV-2 및 HCoV-NL63은 주로 섬모 세포를 감염시킵니다(섬모 마커 유형 IV β-튜불린을 사용한 바이러스 뉴클레오캡시드 염색의 공동 국소화 및 잔 세포 마커 MUC5AC와 바이러스 항원의 공동 국소화 부족으로 입증됨). MERS-CoV는 MUC5AC를 사용한 바이러스 항원 염색의 공동 국소화와 IV형 β-튜불린을 사용한 바이러스 뉴클레오캡시드 염색의 최소 공동 국소화로 반대 패턴을 보이는 것과 같이 비강 ALI 배양에서 섬모가 없는 잔 세포를 주로 감염시킵니다. 액틴 필라멘트에 결합하는 팔로이딘(phalloidin) 또는 상피 세포 접착 분자인 EpCAM(EpCAM)과 같은 마커를 사용하여 상피 세포골격을 시각화하고 상피 장벽 무결성의 손실을 감지할 수 있습니다27. 그림 2B 는 비강 ALI 배양물에서의 팔로이딘 염색을 보여줍니다. 패널 1은 모의 감염 배양에서 온전한 세포골격 F-액틴 초세구조를 보여주고, 패널 2는 팔로이딘 무결성의 손실을 보여주며 HCoV-NL63 감염 배양에서 상피 장벽 기능에 대한 잠재적 손상을 시사합니다. 이와 같은 상피 마커는 감염 중 상피 장벽 역학을 특성화하기 위해 HCoV 감염에 적용할 수 있습니다.
4개의 HCoV 각각에 비강 ALI 배양물을 감염시킨 후 경상피 전기 저항(TEER)을 모니터링했습니다. 기준선 TEER 판독값은 감염 전, 0hpi로 기록되었으며, TEER은 96hpi 및 192hpi에서 각 트랜스웰에 대해 다시 평가되었습니다. 그림 3은 각 HCoV에 대한 TEER 변경 사항을 보여줍니다. 그림 3A,B는 ΔTEER 값을 보여줍니다(주어진 지점에서 측정된 TEER에서 0hpi의 기준선 TEER을 빼서 각 트랜스웰에 대해 계산된 TEER의 차이). SARS-CoV-2, MERS-CoV 및 HCoV-NL63의 경우 TEER의 주요 변화는 감염 후기(192hpi)에 발생하며, 그림 3A는 SARS-CoV-2 및 HCoV-NL63 감염이 음의 ΔTEER 값(192hpi - 0hpi)을 초래하는 반면 MERS-CoV 감염은 그렇지 않음을 보여줍니다. 비교를 위해 모의 ΔTEER 값이 포함되었으며 MERS-CoV 감염 후 TEER의 변화가 모의 감염 중에 나타난 것과 크게 다르지 않음을 보여줍니다. 음의 ΔTEER 값은 상피 장벽 무결성의 감소와 상피 장벽 기능 저하를 나타냅니다. 그림 3B는 HCoV-229E에 대한 ΔTEER 값을 보여줍니다(96hpi 및 192hpi에서 계산). HCoV-229E는 초기 시점(96hpi)에서 상피 장벽 기능 장애를 일으키지만 모의 수준으로의 회복은 이후 시점(192hpi)에서 발생합니다. 이러한 데이터는 TEER 역학이 바이러스 간에 어떻게 다를 수 있는지 보여줍니다. 그림 3C,D는 시간 경과에 따른 각 감염된 횡단웰에 대한 원시 TEER 데이터를 보여주는 TEER 추적을 보여주므로 감염 과정 전반에 걸친 TEER 추세를 시각화할 수 있습니다. 원하는 경우, 사이토카인 IL-13을 사용한 치료는 TEER 실험 중에 양성 대조군으로 포함될 수 있는데, 이는 단단한 접합부를 손상시키고 상피 장벽 기능을 손상시켜 기도 상피의 막 투과성을 증가시키기 때문입니다. 따라서 사이토카인 IL-13은 TEER28,29,30의 감소를 초래할 것으로 예상됩니다.
비강 배양에서 TEER 측정을 보완하기 위해 감염 중에 정점으로 방출되는 젖산 탈수소효소(LDH)의 정량을 통해 세포 독성을 정량화할 수 있습니다. 그림 4 는 분석된 각 HCoV에 감염된 10명의 기증자로부터 유래한 배양에서 얻은 96hpi 및 192hpi의 평균 세포독성 데이터를 보여줍니다. SARS-CoV-2, HCoV-NL63 및 HCoV-229E는 비강 배양에서 상당한 세포 독성을 유발하지만 MERS-CoV는 그렇지 않습니다.
감염된 비강 배양에서 수집된 총 단백질 또는 RNA를 사용하여 다양한 HCoV-숙주 상호 작용을 검사할 수 있습니다. 우리는 잔 세포 증식을 유도하고 천식 기도의 조직 풍경을 모델링하기 위해 제2형 사이토카인 IL-13으로 비강 배양을 처리했습니다. 그림 5A 는 IL-13 처리 후 두 가지 주요 HCoV 수용체의 mRNA 풍부도를 정량화하는 qPCR 데이터를 보여줍니다. DPP4는 MERS-CoV의 세포 수용체이고 ACE2는 SARS-CoV-2 및 HCoV-NL63의 세포 수용체입니다. IL-13 처리는 DPP4 발현을 극적으로 증가시키지만 ACE2 발현에는 큰 변화가 없습니다. 그림 5B 는 감염되지 않은 배양물과 SARS-CoV-2에 감염된 배양물에서 IL-13 처리 후 단백질 풍부도를 평가하기 위한 웨스턴 블롯 데이터를 보여줍니다. IL-13 처리는 MUC5AC(잔 세포 마커)를 크게 증가시키고 IV형 β-튜불린(섬모 세포 마커)을 감소시키며, 이는 이 사이토카인 처리로 인해 예상되는 잔 세포 증식을 반영합니다. 단백질 수준 분석에서 IL-13 처리는 DPP4 발현을 증가시키지만 ACE2 발현은 감소시키는 것으로 나타났습니다. SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 웨스턴 블로팅은 IL-13 처리가 가짜 처리된 배양에 비해 바이러스 항원을 약간 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 비강 ALI 배양 조작 및/또는 HCoV 감염 후 관심 있는 모든 mRNA 또는 단백질에 대해 유사한 분석을 수행할 수 있습니다.
그림 1: 비강 ALI 배양에서의 HCoV 복제. 6명 또는 4명의 기증자로부터 유래한 비강 배양은 MOI = 5에서 SARS-CoV-2(6), MERS-CoV(6), HCoV-NL63(6) 또는 HCoV-229E(4)에 세 번 감염되었습니다. 정점 표면 액체를 0hpi, 48hpi, 96hpi, 144hpi로 채취하고, 플라크 분석으로 감염성 바이러스를 정량화하였다. (A) 각 HCoV에 감염된 모든 기증자의 평균 바이러스 역가가 묘사되어 있습니다. (B) 단일 기증자로부터 유래한 비강 배양은 MOI = 5에서 3회 감염되었고, ASL은 48hpi에서 수집되었습니다. ASL 수집 후, 트랜스웰을 PBS로 3회 세척한 후 동결-해동을 통해 용해하여 세포 내 바이러스를 정량화했습니다. 정점 창고 구획과 세포 내 구획의 감염성 바이러스는 플라크 분석으로 정량화되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 약어: ALI = 공기-액체 인터페이스; MOI = 감염의 다중성; ASL = 정점 표면 액체; HPI = 감염 후 시간; PBS = 인산염 완충 식염수. 이 수치는 Otter et al.1에 발표된 데이터를 사용하여 구성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세포 영양성 및 상피 무결성을 특성화하기 위한 비강 ALI 배양의 면역형광 이미징. (A) 비강 ALI 배양물은 MOI = 5에서 SARS-CoV-2, MERS-CoV 또는 HCoV-NL63에 감염되고 96hpi에서 4% 파라포름알데히드에 고정되었습니다. 배양물은 상기 프로토콜 섹션 6에 설명된 바와 같이, 각 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질(빨간색으로 표시), 섬모 세포 마커 유형 IV β-튜불린(녹색) 또는 잔 세포 마커 MUC5AC(녹색)에 대한 1차 항체를 사용하여 면역형광 이미징을 위해 준비되었습니다. 주목할 점은 MUC5AC 항체와의 종 비호환성으로 인해 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체 대신 MERS-CoV 비구조 단백질 8(nsp8)에 대한 항체가 사용되었다는 것입니다. 바이러스 항원과 각 상피 세포 마커 간의 공동 국소화는 각 바이러스에 대한 병합 이미지에서 주황색/노란색으로 시각화됩니다. (B) 분홍색으로 표시된 것처럼 세포골격 무결성을 시각화하기 위해 팔로이딘(액틴 세포골격 필라멘트를 염색함)을 사용하여 비강 ALI 배양을 염색했습니다. 회슈트 염색은 파란색으로 표시됩니다. 패널 2B.1은 선명하고 온전한 남근 염색을 보여주며 온전한 세포골격 구조를 나타내는 반면, 패널 2B.2는 상피 무결성의 손실과 팔로이딘 염색의 흐림을 보여줍니다. 스케일 바 = (A) 50 μm, (B) 10 μm. 약어: ALI = 공기-액체 인터페이스; MOI = 감염의 다중성; HPI = 감염 후 시간. 이 그림은 Otter et al.에 발표된 데이터를 사용하여 구성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 감염 중 ALI 배양에서 경상피 전기 저항 측정. (A) 10명의 기증자로부터 유래한 비강 ALI 배양물은 모의 감염 또는 MOI = 5에서 SARS-CoV-2, MERS-CoV 또는 HCoV-NL63에 감염되었습니다. ΔTEER는 192hpi에서 TEER에서 0hpi에서 TEER를 뺀 값(기준선 TEER)으로서 각 트랜스웰에 대해 계산되었습니다. 각 막대는 각 기증자의 삼중 배양 중 각 바이러스에 대한 평균 ΔTEER 값을 보여줍니다. (B) 8명의 기증자로부터 유래한 비강 ALI 배양은 MOI = 5에서 모의 감염 또는 HCoV-229E에 감염되었습니다. 기준선 TEER로부터의 ΔTEER는 96hpi 또는 192hpi에서 TEER를 사용하여 (A)에서와 같이 계산되었습니다. (씨,디) TEER 추적 데이터는 4명의 기증자 각각에서 유래한 모의 감염 또는 HCoV 감염 배양에 대해 표시됩니다. 각 라인은 시간 경과에 따른 단일 트랜스웰의 TEER 데이터를 나타냅니다(각 공여체의 3개 트랜스웰이 분석됨). 기부자 번호는 색상으로 구분되어 각 그래프의 오른쪽 키에 표시됩니다. 데이터는 패널 A와 패널 B에서 평균 ± SD로 표시됩니다. 약어: ALI = 공기-액체 인터페이스; MOI = 감염의 다중성; HPI = 감염 후 시간; TEER = 경상피 전기 저항. 이 수치는 Otter et al.1에 발표된 데이터를 사용하여 구성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 비강 ALI 배양의 HCoV 감염 중 세포 독성 정량화. MOI = 5에서 각 HCoV에 3회 감염된 10명의 기증자로부터 유래한 비강 배양은 위에서 설명한 바와 같이 ASL 샘플에서 LDH 정량을 거쳤습니다. 테스트된 모든 기증자의 평균 세포 독성은 96hpi 및 192hpi에서 각 HCoV에 대해 표시됩니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 약어: ALI = 공기-액체 인터페이스; MOI = 감염의 다중성; HPI = 감염 후 시간; TEER = 경상피 전기 저항; ASL = 정점 표면 액체; LDH = 젖산 탈수소효소. 이 수치는 Otter et al.1에 발표된 데이터를 사용하여 구성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 비강 배양 감염 후 mRNA/단백질 분석. 제2형 사이토카인 IL-13으로 처리하거나 가짜 처리한 비강 배양은 HCoV 수용체의 발현 변화와 섬모 및 잔 세포 마커의 변화를 평가하는 데 사용되었습니다. (A) DPP4 및 ACE2 의 mRNA 발현은 RT-qPCR을 통해 정량화되었습니다. IL-13으로 처리한 3명의 기증자의 배양에 대한 데이터는 동일한 기증자로부터 유래한 가짜 처리된 배양에 비해 접힌 변화로 표시됩니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, 각 포인트는 단일 기증자에 대한 평균 접힘 변화 유도를 나타냅니다. (B) 총 단백질은 가짜 또는 IL-13 처리되고 모의 또는 SARS-CoV-2에 감염된 비강 배양에서 수확되었습니다. 단백질을 SDS-PAGE 를 통해 분리하고 상피 세포 마커(IV형 β-튜불린, MUC5AC), HCoV 수용체(ACE2, DPP4), SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 및 GAPDH에 대한 항체로 면역 응고되었습니다. 약어: RT-qPCR = 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응; SDS-PAGE = 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동. 이 수치는 Otter et al.1에 발표된 데이터를 사용하여 구성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 자세히 설명된 방법은 환자 유래 비강 상피 세포가 공기-액체 계면에서 성장하고 HCoV-숙주 상호 작용 연구에 적용되는 1차 상피 배양 시스템을 설명합니다. 일단 분화되면, 이러한 비강 ALI 배양은 섬모, 잔 및 기저 세포가 대표되는 이질적인 세포 집단뿐만 아니라 섬모와 점액 분비가 강력하게 박동하는 온전한 점액 섬모 기능을 포함하여 생체 내 비강 상피의 많은 특징을 요약합니다. 이러한 이질적인 세포 집단은 바이러스 감염 중 숙주 세포 영양성의 특성을 분석할 수 있기 때문에 기존 호흡기 상피 세포주에 비해 이 배양 시스템의 주요 이점입니다( 그림 2 참조). 또한 전통적인 기도 상피 세포주에는 인터페론 생성과 같은 선천성 면역 경로와 함께 호흡기 바이러스에 대한 1차 방어에 중요한 역할을 하는 기능적 점액섬모 제거 메커니즘이 없습니다.
프로토콜 내의 중요한 단계에는 초기 감염 절차가 포함됩니다. 예를 들어, 배양액은 감염 전에 원하는 온도에서 평형을 이루어야 하며, 각 감염을 시작하기 위해 일관된 방법론을 사용해야 합니다. 이러한 단계는 분석법을 표준화하고 다운스트림 결과의 재현성을 보장하는 데 매우 중요합니다.
이러한 방법의 가장 중요한 부분은 각 HCoV의 고유한 복제 주기를 이해하면 추가 분석에 가장 적합한 시점을 결정하는 데 도움이 되기 때문에 정점으로 방출된 바이러스의 정량화일 것입니다. 대표적인 이질적인 세포 집단이 있는 체외 비강 상피에서 바이러스 감염을 시각화할 수 있는 능력은 바이러스 영양성을 정확하게 평가할 수 있고 생리학적 환경에서 바이러스-숙주 상호 작용을 추가로 쿼리할 수 있는 기능을 제공하기 때문에 위에서 설명한 면역형광 기술도 중요합니다.
비강 상피는 모든 호흡기 바이러스가 만나는 1차 장벽 부위이므로 HCoV 감염은 비강 상피의 1차 감염으로 시작되어 구강-폐 흡인 축을 통해 하부 기도로 퍼질 가능성이 있습니다. 이는 병원성 HCoV 감염(MERS-CoV, SARS-CoV-2) 시 중증 폐렴 및 호흡기 질환의 발병에 중요한 역할을 할 가능성이 높으며, 계절성 HCoV는 상기도에서만 질병을 유발하는 경향이 있습니다. 이 중요한 면역 감시 부위에서 HCoV-숙주 상호 작용을 이해하는 것이 중요하며, 이 비강 ALI 시스템을 통해 HCoV 감염 중 바이러스 복제, 숙주 세포 영양성, 세포 독성 및 선천성 면역 유도의 특성을 분석할 수 있습니다.
이 비강 ALI 배양 시스템은 또한 적응력이 뛰어나 많은 임상 질병 상태를 반영하는 데 사용할 수 있습니다. 낭포성 섬유증(염화물 채널 결함에 의해 발생) 또는 원발성 섬모 운동이상증(섬모 박동 메커니즘이 제대로 기능하지 않는 경우)과 같은 유전성 폐 질환 환자로부터 얻은 비강 검체는 이러한 병리를 대표하는 비강 ALI 배양을 배양하여 이러한 환자가 HCoV 감염에 의해 어떻게 차별적으로 영향을 받을 수 있는지 이해하는 데 사용할 수 있습니다31,32. 또한 비강 ALI 배양을 분화하는 동안 다양한 사이토카인 치료를 사용하여 다른 질병 상태의 특징을 재현할 수 있습니다. 예를 들어, 분화 중 IL-13 처리는 잔 세포 증식을 유도하고 천식 또는 알레르기성 기도 연구를 위한 대리물로 사용될 수 있다33,34. 따라서 이 비강 ALI 시스템은 건강한 기도 및 병든 기도 모두에서 HCoV 숙주 및 기타 바이러스-숙주 상호 작용을 조사하기 위한 강력한 도구입니다.
이 시스템은 많은 이점을 제공하지만, 비강 ALI 배양을 사용할 때 몇 가지 한계가 있습니다. 비강 세포는 기관지 또는 폐 세포보다 획득에 훨씬 덜 침습적인 기술이 필요하지만, ALI 배양을 성장시키고 분화하려면 기존의 불멸화된 세포주를 사용하는 것보다 훨씬 더 많은 시간과 자원이 필요합니다. 또한 감염에 대한 관대함과 HCoV 감염에 대한 숙주 반응 측면에서 기증자 간 변동성으로 인해 데이터를 재현하고 해석하는 것이 더 어려워질 수 있습니다(이러한 문제를 완화하기 위해 5-10명의 기증자에서 유래한 배양액으로 실험을 수행하는 경우가 많습니다).
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Disclosures
수잔 와이스(Susan Weiss)는 오큐젠(Ocugen)의 과학 자문 위원회에 소속되어 있습니다. 노암 A. 코헨(Noam A. Cohen)은 GSK, 아스트라제네카(AstraZeneca), 노바티스(Novartis), 사노피/레제론(Sanofi/Regeron), 오이스터 포인트 파마슈티컬스(Oyster Point Pharmaceuticals)의 자문을 맡고 있으며, 미국 특허인 "호흡기 감염 치료 및 진단"(10,881,698 B2, WO20913112865)을 보유하고 있으며, GeneOne Life Sciences와 라이선스 계약을 체결했습니다.
Acknowledgments
이 연구의 자금 출처는 다음과 같습니다: 미국 국립보건원(NIH) R01AI 169537(S.R.W. 및 N.A.C.), NIH R01AI 140442(S.R.W.), VA Merit Review CX001717(N.A.C.), VA Merit Review BX005432(S.R.W. 및 N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens(S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation(S.R.W. 및 N.A.C.), T32 AI055400(CJO), T32 AI007324(AF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
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