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Immunology and Infection

Infecção de Células Epiteliais Primárias Nasais Cultivadas em Interface Ar-Líquido para Caracterizar Interações Coronavírus-Hospedeiro Humano

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/64868
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3,4, 1,2, 3,4
1Department of Microbiology, University of Pennsylvania, 2Penn Center for Research on Coronaviruses and Other Emerging Pathogens, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Pennsylvania, 4Corporal Michael J. Crescenz VA Medical Center

Summary

O epitélio nasal é o principal sítio de barreira encontrado por todos os patógenos respiratórios. Aqui, descrevemos métodos para usar células epiteliais nasais primárias cultivadas como culturas de interface ar-líquido (LPA) para caracterizar interações coronavírus-hospedeiro humano em um sistema fisiologicamente relevante.

Abstract

Três coronavírus humanos altamente patogênicos (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) e SARS-CoV-2 (2019) - emergiram e causaram crises de saúde pública significativas nos últimos 20 anos. Quatro HCoVs adicionais causam uma parcela significativa de casos de resfriado comum a cada ano (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1), destacando a importância do estudo desses vírus em sistemas fisiologicamente relevantes. Os HCoVs entram no trato respiratório e estabelecem a infecção no epitélio nasal, o sítio primário encontrado por todos os patógenos respiratórios. Usamos um sistema primário de cultura epitelial nasal no qual amostras nasais derivadas do paciente são cultivadas em uma interface ar-líquido (LPA) para estudar as interações patógeno-hospedeiro neste importante sítio sentinela. Essas culturas recapitulam muitas características da via aérea in vivo , incluindo os tipos celulares presentes, a função ciliar e a produção de muco. Descrevemos métodos para caracterizar a replicação viral, o tropismo de células hospedeiras, a citotoxicidade induzida por vírus e a indução de imune inata em culturas nasais de LPA após infecção por HCoV, usando trabalhos recentes comparando HCoVs letal e sazonal como exemplo1. Uma maior compreensão das interações hospedeiro-patógeno no nariz tem o potencial de fornecer novos alvos para a terapêutica antiviral contra HCoVs e outros vírus respiratórios que provavelmente surgirão no futuro.

Introduction

Sete coronavírus humanos (HCoVs) foram identificados até o momento e causam uma série de doenças respiratórias2. Os HCoVs comuns ou sazonais (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1) são tipicamente associados à patologia do trato respiratório superior e causam cerca de 10%-30% dos casos de resfriado comum anualmente. Embora esse seja o fenótipo clínico típico associado ao HCoVs, esses vírus podem causar doença mais significativa do trato respiratório inferior em populações de risco, incluindo crianças, idosos e indivíduos imunocomprometidos 3,4. Três HCoVs patogênicos surgiram e causaram emergências de saúde pública significativas nos últimos 20 anos, incluindo síndrome respiratória aguda grave (SARS)-CoV, síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS)-CoV e SARS-CoV-2. Os HCoVs letais estão associados a patologias mais graves do trato respiratório, o que é claramente ilustrado pela taxa de letalidade de >34% associada aos casos de MERS-CoV (894 mortes em mais de 2.500 casos desde seu surgimento em 2012)5,6. É importante notar que os HCoVs letais também causam uma série de doenças do trato respiratório, desde infecções assintomáticas até pneumonia letal, como visto com a pandemia COVID-19 em curso7.

Os HCoVs, como outros patógenos respiratórios, entram no trato respiratório e estabelecem uma infecção produtiva no epitélionasal8. Acredita-se que a disseminação para a via aérea inferior esteja associada à aspiração da cavidade oral/nasal para o pulmão, onde os HCoVs causam patologia mais significativa do trato respiratório inferior9,10,11. Assim, o nariz serve como o portal inicial para a entrada viral e é a barreira primária à infecção com sua robusta maquinaria de depuração mucociliar e mecanismos imunes inatos únicos destinados a prevenir a disseminação viral para as vias aéreasinferiores12,13. Por exemplo, foi relatado que células epiteliais nasais expressam níveis basais acima da média de interferons antivirais e genes estimulados por interferon, indicando que as células nasais podem ser preparadas para respostas precoces a vírus respiratórios14,15,16.

Utilizamos previamente células epiteliais nasais primárias derivadas do paciente cultivadas em uma interface ar-líquido (LPA) para modelar as interações HCoV-hospedeiro no nariz, onde as infecções por HCoV começam. As culturas nasais de LPA são permissivas tanto para HCoVs patogênicos (SARS-CoV-2 e MERS-CoV) quanto para HCoVs comuns (HCoV-NL63 e HCoV-229E) e oferecem várias vantagens sobre linhagens celulares epiteliais tradicionais das vias aéreas, como a A549 (uma linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar)16,17. Após a diferenciação, as culturas nasais de LPA contêm uma população celular heterogênea e exibem muitas das funções esperadas do epitélio nasal in vivo, como a maquinaria de depuração mucociliar18. As células nasais também oferecem vantagens sobre os sistemas de cultura das vias aéreas inferiores (como as células epiteliais brônquicas humanas, HBECs), uma vez que a aquisição de células epiteliais nasais via escovação citológica é significativamente menos invasiva em comparação com o uso de técnicas como a broncoscopia para a obtenção de HBECs 19,20,21.

Este trabalho descreve métodos de utilização deste sistema de cultura de LPA nasal para caracterizar as interações HCoV-hospedeiro no epitélio nasal. Nós aplicamos estes métodos em trabalhos recentemente publicados para comparar SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63, e HCoV-229E 1,16,17. Embora esses métodos e resultados representativos enfatizem o estudo dos HCoVs neste modelo de células nasais, o sistema é altamente adaptável a outros HCoVs, bem como a outros patógenos respiratórios. Além disso, esses métodos podem ser aplicados de forma mais ampla a outros sistemas de cultura de LPA, a fim de investigar a replicação viral e o tropismo celular, bem como a citotoxicidade e a indução imune inata após a infecção.

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Protocol

O uso de espécimes nasais foi aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade da Pensilvânia (protocolo # 800614) e pelo Comitê de Revisão Institucional da Filadélfia VA (protocolo # 00781).

1. Infecção de culturas nasais de LPA

NOTA: A aquisição de espécimes clínicos, bem como o crescimento e diferenciação de culturas nasais de LPA, está fora do escopo deste trabalho. Métodos específicos para a cultura de células epiteliais nasais primárias podem ser encontrados em trabalhos publicados recentemente utilizando essas culturas18,22,23. Os protocolos abaixo podem adicionalmente ser aplicados a culturas de LPA epitelial nasal comercialmente disponíveis, se desejado. Os protocolos e volumes detalhados abaixo são aplicáveis a insertos de transpoço de placa de 24 poços (6,5 mm de diâmetro, 0,33 cm de área de superfíciede membrana 2). Se usar culturas de LPA cultivadas em transpoços maiores (isto é, placas de 12 poços, 12 mm de diâmetro, 1,12 cm2 de área de superfície), ajuste os volumes proporcionalmente para refletir o tamanho do transpoço.

  1. Dia antes da infecção:
    1. Lavar culturas de LPA 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) apicamente (adicionar ~200 μL de PBS aquecido, colocar em incubadora a 37 °C por 5 min, aspirar PBS e repetir).
    2. Substitua o meio basal (500 μL).
    3. Permitir que as culturas se equilibrem na temperatura em que as infecções serão conduzidas durante a noite (ou seja, se infectar a 33 °C, coloque as culturas em uma incubadora de 33 °C após as lavagens com PBS).
      NOTA: HCoVs associados ao resfriado comum, como HCoV-229E e HCoV-NL63, são relatados para replicar de forma mais eficiente a 33 °C. Além disso, a temperatura do epitélio nasal in vivo é de 33 °C (isso difere da temperatura do pulmão, que é de 37 °C).
  2. Diluir o vírus conforme necessário no meio de águia modificado (DMEM) de Dulbecco livre de soro para atingir a multiplicidade desejada de infecção (MOI) em um volume total de inóculo de 50 μL.
    NOTA: As infecções têm sido tipicamente conduzidas em MOI = 5 (MOI alto); no entanto, infecções em MOI = 0,5 (MOI baixo) também foram usadas para SARS-CoV-2 e HCoVs associado ao resfriado comum, e estes resultam em títulos virais de pico comparáveis, mas com cinética variável (qualquer MOI é aceitável).
  3. Adicione inóculo apicamente e coloque as culturas de volta na incubadora por 1 h.
  4. Placas de rocha suavemente a cada 15 minutos durante a infecção (segurando a placa firmemente em ambas as mãos, balança para frente e para trás e de um lado para o outro para garantir a adsorção uniforme do inóculo viral).
  5. Após 1 h de incubação, aspirar o inóculo viral e lavar cada cultura infectada 3x com PBS para garantir a remoção do inóculo viral (para cada lavagem, adicionar 200 μL de PBS, incubar por 5 min e aspirar ou remover com uma pipeta).
  6. Se desejar, colete a terceira lavagem PBS para confirmar a remoção adequada do vírus de entrada.
  7. Substitua o meio basal por meio fresco nas LPA infectadas a cada 72 h durante a infecção.

2. Coleta de líquido de superfície apical (ASL) e titulação do vírus excretado

  1. Em momentos pré-determinados após a infecção, adicionar 200 μL de PBS à câmara apical de cada transwell infectado.
    NOTA: Os pontos de tempo relevantes variam dependendo do HCoV de interesse e variam de 24 h a 192 h após a infecção (consulte a seção de resultados representativos para obter dados de replicação viral para vários HCoVs).
  2. Pipetar PBS para cima e para baixo 5x para garantir a coleta máxima de vírus derramado apicamente, e coletar todo o volume em um tubo de microcentrífuga (esta é a amostra ASL).
    NOTA: ASL inclui partículas virais derramadas, além de muco e outros produtos secretados apicamente de culturas de ALI.
  3. Quantificar vírus infecciosos em ASL através de ensaio padrão de placa viral (diluir serialmente amostras contendo vírus para quantificar a concentração de partículas virais).
    NOTA: Os tipos celulares e o período de incubação usados para o ensaio da placa dependerão do vírus usado: SARS-CoV-2 (células VeroE6); MERS-CoV (células VeroCCL81); HCoV-NL63 (células LLC-MK2); HCoV-229E (células Huh7). Detalhes sobre como conduzir ensaios de placa viral estão além do escopo deste manuscrito, mas foram detalhados anteriormente em uma publicação do Journal of Visualized Experiments (JoVE)24.
  4. Se desejar, coletar o meio basal em vários momentos pós-infecção para confirmar a ausência de vírus liberados basalmente. Os HCoVs são tipicamente liberados apicamente das células epiteliais nasais, mas confirmam isso por meio do ensaio de placa do meio basal não diluído.
  5. Armazenar amostras de ASL a -80 °C se a quantificação por ensaio de placa não ocorrer no dia da coleta.

3. Quantificação do vírus intracelular

  1. Após a coleta da amostra de ASL, mova cada transwell para uma placa limpa de 24 poços pré-carregada com 500 μL de DMEM contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) basalmente.
    NOTA: DMEM com 2% FBS é usado para estabilizar o vírus durante ciclos subsequentes de congelamento-descongelamento.
  2. Lave cada transwell 3x apicamente com PBS para garantir a remoção completa do vírus derramado apicamente.
  3. Após aspirar para remover a lavagem final com PBS, adicionar 100 μL de DMEM com SFB a 2% ao compartimento apical.
  4. Mova a placa que contém transwells com meios apical e basal para um congelador de -80 °C e complete três ciclos consecutivos de congelamento-descongelamento para lisar as células.
  5. Após o ciclo final de congelamento-descongelamento, coloque os meios apical (100 μL) e basal (500 μL) em um tubo limpo.
  6. Centrifugar a 500 × g durante 10 min a 4 °C para pellet de quaisquer detritos celulares.
  7. Colete o sobrenadante. Esta é a amostra de vírus intracelular para titulação via ensaio de placa padrão.
    NOTA: A diluição de três vezes ocorre durante o processo de coleta em relação à coleta de ASL; As amostras de ASL são coletadas em 200 μL de PBS, enquanto a amostra de vírus intracelular é coletada em um volume total de 600 μL.

4. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER)

NOTA: Para a medição do TEA, deve-se usar PBS suplementado com cálcio e magnésio (PBS + Ca 2+/Mg2+). Um volt/ohmímetro epitelial ajustado para leitura em ohms é usado (veja a Tabela de Materiais).

  1. Limpar, equilibrar e deixar em branco o instrumento EVOM de acordo com as instruções do fabricante; usar um transwell "vazio" sem adição de células nasais para blanking. Registre a medição TEER em branco.
    NOTA: Se estiver usando vários vírus, o instrumento EVOM deve ser limpo rigorosamente entre as condições para evitar contaminação cruzada (lavagens com etanol 70% seguidas de água deionizada são suficientes).
  2. Mover cada transwell infectado para uma placa pré-marcada e limpa de 24 poços com 500 μL de PBS + Ca 2+/Mg2+ basalmente para lavar o meio basal residual das transwells.
  3. Adicionar 200 μL de PBS + Ca 2+/Mg2+ ao compartimento apical de cada transwell.
  4. Adicionar 1 mL de PBS + Ca 2+/Mg2+ à câmara de medição de Endohm-6.
  5. Mover cada transwell para a câmara de medição Endohm-6 e substituir a tampa da câmara de modo que o eletrodo apical descanse nos 200 μL de PBS no compartimento apical; o eletrodo basal é construído no fundo da câmara Endohm-6.
  6. Permita que a leitura EVOM se estabilize e registre a medição bruta do TEAR.
  7. Coletar amostra de ASL conforme descrito acima após a medição de TEER se a titulação for desejada (coletar os 200 μL de PBS + Ca 2+/Mg2+ que foi adicionado para a medição de TEA).
    NOTA: A coleta de amostras de ASL pode induzir micro-rupturas na barreira epitelial que podem confundir as leituras de TEA, portanto, a ASL deve ser coletada após a medição de TEA. Além disso, o meio basal não deve ser trocado imediatamente antes das leituras ITER, pois isso também pode afetar os valores de ITER.
  8. Para converter as leituras brutas do TEER em medidas finais em Ohms/cm2, subtraia o valor TEER em branco e multiplique esse valor pela área superficial da membrana do transpoço usando a equação (1):
    TEER = [leitura TEER - valor TEER em branco] × (área de superfície da transwell) (1)
  9. Para HCoVs, avaliar TEER a cada 24 h ou 48 h após a infecção; a cinética das alterações TEER geralmente varia entre os vírus e requer solução de problemas em vários pontos de tempo.
  10. Ao medir o TEER, inclua sempre culturas simuladas infectadas e avalie em cada momento (controle negativo).
    NOTA: Para culturas simuladas, as medições TEER devem permanecer estáveis ou podem aumentar ligeiramente a partir da linha de base após a diferenciação das culturas ser concluída. A área de superfície dos suportes de membrana irá variar dependendo do tamanho e do fabricante dos transwells; As transwells de 24 poços normalmente têm uma área de superfície de 0,33 cm2.

5. Mensuração da citotoxicidade durante a infecção pelo ensaio de lactato desidrogenase (LDH)

NOTA: Neste trabalho, o conteúdo de LDH em amostras de ASL foi quantificado usando um kit de detecção de citotoxicidade disponível comercialmente. O sinal de LDH em meio basal foi frequentemente abaixo do limite de detecção e muitas vezes menos reprodutível do que o LDH quantificado em amostras de ASL de culturas infectadas com HCoV.

  1. Preparar controles adicionais necessários para o ensaio de LDH.
    1. Controle de antecedentes: usar PBS (usar PBS contendo cálcio e magnésio se amostras de ASL foram coletadas dessa forma).
    2. Controle positivo (valor teto): tratar as LPA apicamente com Triton X-100. Colete poços de controle Triton (normalmente use três culturas ALI para isso em cada ponto de tempo).
      1. Adicionar 200 μL de Triton X-100 a 2% em PBS diretamente ao compartimento apical do transwell.
      2. Incubar por 10-15 min para permitir que as células lisem completamente.
      3. Colete todo o volume como uma amostra do teto Triton.
    3. Controle negativo (baixo controle/liberação basal de LDH): coletar ASL de culturas de LPA infectadas simuladas derivadas do mesmo doador que culturas infectadas.
      1. Colete ASL simulado de controle negativo seguindo o procedimento de coleta de ASL acima.
        NOTA: Os mesmos transwells podem ser usados para este controle negativo para todos os pontos de tempo, enquanto transwells frescos serão necessários para cada ponto de tempo para o controle Triton.
  2. Para permitir a quantificação do vírus derramado, além das leituras de LDH de cada amostra ASL, carregue uma placa preta de fundo plano opticamente transparente de 96 poços da seguinte maneira:
    1. Diluir todas as amostras em PBS, utilizando 45 μL de amostra e 55 μL de PBS (100 μL de volume total).
    2. Trate o controle positivo Triton e simule amostras de controle de fundo da mesma maneira.
      NOTA: Esta diluição permite o carregamento em triplicata de cada amostra experimental (45 μL x 3) e volume residual de ASL suficiente para titulação por ensaio de placa.
    3. Carregue a placa de LDH em triplicata: teto Triton, controle de fundo simulado, controle PBS e amostras experimentais.
    4. Preparar a mistura de reação conforme indicado pelo fabricante (solução de corante + catalisador).
      1. Adicionar 100 μL de mistura de reação a cada poço e incubar a placa à temperatura ambiente por 20 min protegida da luz.
    5. Após 20 min, medir a absorbância a 492 nm.
    6. Calcular a porcentagem de citotoxicidade em relação ao valor teto de Triton usando a equação (2).
      Citotoxicidade (%) Equation 1 (2)

6. Preparo de culturas nasais de LPA para imagem de imunofluorescência (IF)

  1. Mova o transwell para uma placa fresca de 24 poços e lave 3x apicamente com PBS (colete a primeira lavagem PBS como ASL se titer; em seguida, execute duas lavagens PBS adicionais para remover o excesso de vírus derramado que pode prejudicar a qualidade do FI)
  2. Após a lavagem final com PBS, cobrir o transbem apical e basalmente em PFA a 4%.
  3. Incubar por 30 min para fixar em PFA a 4% e, em seguida, remover e lavar 3x com PBS.
  4. Excise o suporte de transwell que contém as células usando uma lâmina de barbear afiada ou tesoura.
  5. Para aumentar o número de alvos de FI para cada transwell, corte cada membrana ao meio e core cada metade com diferentes combinações de anticorpos.
  6. Permeabilizar com Triton X-100 a 0,2% em PBS por 10 min.
  7. Bloqueio com 10% de soro de burro normal e 1% de BSA em PBST (PBS + 0,2% Triton X-100) por 60 min à temperatura ambiente.
    NOTA: Proteja as amostras da exposição à luz a partir deste passo em frente.
  8. Incubar em solução primária de anticorpos durante a noite a 4 °C. Diluir todos os anticorpos 1:1.000 em tampão de bloqueio.
    NOTA: Anticorpos representativos para a coloração de nucleocapsídeo HCoV, bem como marcadores de tipo celular epitelial e colorações citoesqueléticas, estão listados abaixo (consulte a Tabela de materiais para obter informações sobre o fabricante e números de catálogo).
    1. Para a coloração do antígeno HCoV, use anticorpos direcionados ao nucleocapsídeo SARS-CoV-2, ao nucleocapsídeo MERS-CoV e ao nucleocapsídeo HCoV-NL63.
    2. Para identificar os tipos celulares epiteliais, utilizar anticorpos direcionados ao marcador de células caliciformes MUC5AC e ao marcador de células ciliadas tipo IV β-tubulina.
    3. Para marcadores citoesqueléticos, utilizar anticorpos direcionados contra faloidina (liga-se à F-actina) e marcador de adesão de células epiteliais: EpCAM (CD326).
  9. Incubar em solução de anticorpos secundários durante 60 minutos à temperatura ambiente; usar corantes de anticorpos secundários diluídos 1:1.000 em tampão de bloqueio.
  10. Após a cicatrização estar completa, transfira a membrana para uma lâmina de vidro com uma espátula, oriente o transwell com o lado apical em direção à lâmina e adicione a solução de montagem. Deixe descansar por 15-30 minutos antes de aplicar esmalte claro ao redor das bordas.
  11. Adquirir imagens utilizando microscópio confocal (passo eixo Z: 0,5 μm; varredura sequencial)1,16,17.
    NOTA: Após fixação das culturas em PFA a 4% e lavagem com PBS, as culturas fixas podem ser armazenadas a 4 °C por semanas a meses antes da coloração e preparação para exames de imagem. Após coloração e montagem das membranas, as amostras podem ser armazenadas a longo prazo (>2 anos) a 4 °C no escuro.

7. Coleta de proteína intracelular para western immunoblotting ou RNA para análise de RT-qPCR

  1. Coletar ASL conforme descrito acima se quantificar títulos virais (protocolo seção 2).
  2. Mova o transwell para uma placa limpa de 24 poços, pois raspar a membrana pode levar à quebra da inserção.
  3. Para a análise de western blot, coletar lisado proteico total em 125 μL de tampão RIPA (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS, 1% NP40) suplementado com inibidores de protease e inibidores de fosfatase.
  4. Adicionar 125 μL de tampão RIPA ao compartimento apical e incubar por 5-10 min.
  5. Raspe a membrana usando uma ponta de pipeta P200 para remover as células aderidas restantes e colete todo o volume (raspe vigorosamente em toda a superfície da membrana e, em seguida, pipete para cima e para baixo várias vezes para coletar toda a amostra).
  6. Incubar amostras de lisado proteico no gelo durante 10 min e, em seguida, centrifugar à velocidade máxima (20.000 × g) durante 10 min a 4 °C.
  7. Misturar o sobrenadante com tampão de amostra Laemmli 4x com β-mercaptoetanol (agente redutor) de acordo com os protocolos do fabricante.
  8. Ferver amostras de proteína a 95 °C por 5 min e, em seguida, executar usando protocolos tradicionais de western blotting 1,16,17.
  9. Para a coleta de RNA total, use um kit de extração de RNA disponível comercialmente de escolha.
    NOTA: O compartimento apical das pastilhas transwell de 24 poços tem um volume máximo de ~200 μL; Assim, realizamos duas lavagens sequenciais em cada cultura para atingir o volume total recomendado. Os detalhes abaixo correspondem à coleta recomendada de amostras de RNA em um volume total de 350 μL.
  10. Adicionar 200 μL de tampão de lise ao compartimento apical da transwell infectada.
  11. Deixe descansar por 5-10 min, raspe todas as células restantes da membrana usando uma ponta de pipeta e colete todo o volume em um tubo de microcentrífuga marcado.
  12. Adicionar 150 μL de tampão de lise adicional ao compartimento apical do transwell e pipetar para cima e para baixo antes de coletar no mesmo tubo de microcentrífuga.
  13. Extrair RNA de acordo com o protocolo do fabricante.

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Representative Results

Os números representativos são parcialmente adaptados a partir de dados que podem ser encontrados no manuscrito Otter et al.1. Culturas nasais de LPA derivadas de quatro ou seis doadores foram infectadas com um dos quatro HCoVs (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 e HCoV-229E) de acordo com os protocolos descritos acima, e os títulos virais médios eliminados apicamente para cada vírus estão representados na Figura 1A. Enquanto todos esses quatro HCoVs se replicam produtivamente em culturas ALI nasais, SARS-CoV-2 e HCoV-229E replicam o mais eficiente. Note-se que esses são títulos virais médios, e que títulos para cada HCoV em doadores individuais foram recentemente publicados1. Após a lavagem das culturas nasais de LPA, conforme descrito na seção 3 do protocolo, os títulos de MERS-CoV no líquido de superfície apical (ASL) são comparados com os títulos virais intracelulares na Figura 1B. Os títulos virais intracelulares e de liberação apical do MERS-CoV são aproximadamente os mesmos 48 h após a infecção (hpi).

A imagem por imunofluorescência de culturas de LPA nasal infectada é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar o tropismo celular e outros parâmetros de infecção, como formação de sincícios, fusão célula-célula e danos à integridade da barreira epitelial. A cocoloração de culturas infectadas com anticorpos específicos para antígenos virais (como proteínas não estruturais do nucleocapsídeo ou HCoV) e marcadores para células ciliadas ou caliciformes (β-tubulina tipo IV e MUC5AC, respectivamente) pode determinar tropismo celular para HCoV em LPAs nasais25,26. A Figura 2A mostra imagens representativas de culturas nasais infectadas com SARS-CoV-2, MERS-CoV e HCoV-NL63.

SARS-CoV-2 e HCoV-NL63 infectam principalmente pilhas ciliadas (evidenciada pela colocalização da coloração do nucleocapsídeo viral com o marcador cilia tipo IV β-tubulina e falta da colocalização do antígeno viral com o marcador da pilha caliciforme MUC5AC). O MERS-CoV infecta predominantemente células caliciformes não ciliadas em culturas nasais de LPA, pois o MERS-CoV mostra o padrão oposto, com colocalização da coloração do antígeno viral com MUC5AC e mínima colocalização do nucleocapsídeo viral com β-tubulina tipo IV. Marcadores como a faloidina, que se liga aos filamentos de actina, ou a EpCAM, molécula de adesão celular epitelial, podem ser utilizados para visualizar o citoesqueleto epitelial e detectar perda da integridade da barreiraepitelial27. A Figura 2B mostra a coloração de faloidina nas culturas nasais de LPA; o painel 1 mostra a ultraestrutura intacta da F-actina do citoesqueleto em uma cultura simulada, e o painel 2 mostra uma perda da integridade da faloidina e sugere dano potencial à função da barreira epitelial em uma cultura infectada pelo HCoV-NL63. Marcadores epiteliais como esses podem ser aplicados em infecções por HCoV para caracterizar a dinâmica da barreira epitelial durante a infecção.

Após infecção das culturas nasais de LPA com cada um dos quatro HCoVs, a resistência elétrica transepitelial (TEER) foi monitorada. As leituras basais do TEER foram registradas antes da infecção, 0 hpi, e o TEER foi novamente avaliado para cada transwell a 96 hpi e 192 hpi. A Figura 3 mostra as alterações TEER para cada um dos HCoVs. A Figura 3A,B mostra os valores de ΔTEER (diferenças no TEER calculadas para cada transwell subtraindo o TEER basal a 0 hpi do TEER medido em qualquer ponto). Para SARS-CoV-2, MERS-CoV, e HCoV-NL63, as principais mudanças no TEER ocorrem no final da infecção (192 hpi), e a figura 3A ilustra que as infecções SARS-CoV-2 e HCoV-NL63 resultam em valores negativos de ΔTEER (192 hpi - 0 hpi), enquanto a infecção por MERS-CoV não. Valores simulados de ΔTEER são incluídos para comparação e ilustram que as mudanças no TEER após a infecção por MERS-CoV não são significativamente diferentes daquelas observadas durante a infecção simulada. Valores negativos de ΔTEER indicam diminuição da integridade da barreira epitelial e comprometimento da função da barreira epitelial. A Figura 3B mostra os valores de ΔTEER para HCoV-229E (calculados a partir de 96 hpi e 192 hpi). O HCoV-229E causa disfunção da barreira epitelial no momento anterior (96 hpi), mas a recuperação para níveis simulados ocorre no momento posterior (192 hpi). Esses dados destacam como a cinética TEER pode diferir entre os vírus. A Figura 3C,D mostra os traços TEER, que retratam os dados brutos do TEER para cada transwell infectado ao longo do tempo, permitindo assim a visualização das tendências TEER ao longo da infecção. Se desejado, o tratamento com a citocina IL-13 pode ser incluído como controle positivo durante os experimentos ITER, pois isso prejudica as tight junctions, compromete a função da barreira epitelial e, portanto, aumenta a permeabilidade da membrana nos epitélios das vias aéreas; portanto, espera-se que a citocina IL-13 resulte em diminuição do TEER28,29,30.

Para complementar as dosagens TEER em culturas nasais, a citotoxicidade pode ser quantificada através da quantificação da desidrogenase lática (LDH) liberada apicamente durante a infecção. A Figura 4 apresenta os dados médios de citotoxicidade a 96 hpi e 192 hpi de culturas derivadas de 10 doadores infectados com cada um dos HCoVs dosados. SARS-CoV-2, HCoV-NL63 e HCoV-229E causam citotoxicidade significativa em culturas nasais, enquanto MERS-CoV não.

A proteína total ou o RNA coletado de culturas nasais infectadas podem ser usados para examinar várias interações HCoV-hospedeiro. Tratamos culturas nasais com a citocina tipo 2 IL-13 para induzir hiperplasia de células caliciformes e modelar a paisagem tecidual de uma via aérea asmática. A Figura 5A mostra dados de qPCR quantificando a abundância de RNAm de dois receptores principais de HCoV após o tratamento com IL-13. DPP4 é o receptor celular para MERS-CoV, e ACE2 é o receptor celular para SARS-CoV-2 e HCoV-NL63. O tratamento com IL-13 resulta em aumento dramático da expressão de DPP4, mas sem alterações significativas na expressão de ECA2. A Figura 5B mostra dados de western blot para avaliar a abundância de proteínas após o tratamento com IL-13 em culturas não infectadas e infectadas por SARS-CoV-2. O tratamento com IL-13 resulta em aumento significativo da MUC5AC (um marcador de células caliciformes) e diminuição da β-tubulina tipo IV (um marcador de células ciliadas), refletindo a hiperplasia esperada de células caliciformes causada por esse tratamento com citocinas. A análise do nível de proteína mostra que o tratamento com IL-13 aumenta a expressão de DPP4, mas diminui a expressão de ACE2. O western blotting para a proteína do nucleocapsídeo do SARS-CoV-2 revela que o tratamento da IL-13 resulta numa ligeira diminuição do antigénio viral em comparação com as culturas tratadas com simulação. Análises semelhantes podem ser realizadas para qualquer mRNA ou proteína de interesse após manipulação de culturas nasais de LPA e/ou infecção por HCoVs.

Figure 1
Figura 1: Replicação do HCoV em culturas nasais de LPA. Culturas nasais derivadas de seis ou quatro doadores foram infectadas em triplicata com SARS-CoV-2 (6), MERS-CoV (6), HCoV-NL63 (6) ou HCoV-229E (4) em MOI = 5. O líquido de superfície apical foi coletado em 0 hpi, 48 hpi, 96 hpi e 144 hpi, e o vírus infeccioso foi quantificado por ensaio de placa. (A) Os títulos virais médios de todos os doadores infectados com cada HCoV são descritos. (B) Culturas nasais derivadas de um único doador foram infectadas em triplicata no MOI = 5, e a ASL foi coletada aos 48 hpi. Após a coleta de ASL, os transwells foram lavados 3x com PBS e, em seguida, lisados por congelamento-descongelamento para quantificação do vírus intracelular. O vírus infeccioso no compartimento de eliminação apical versus no compartimento intracelular foi quantificado por ensaio de placa. Os dados são apresentados como média ± DP. Abreviações: ALI = interface ar-líquido; MOI = multiplicidade de infecção; ASL = líquido superficial apical; HPI = horas pós-infecção; PBS = solução salina tamponada com fosfato. Esse valor foi construído com base nos dados publicados em Otter et al.1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagem por imunofluorescência de culturas nasais de LPA para caracterizar tropismo celular e integridade epitelial. (A) As culturas nasais de LPA foram infectadas com SARS-CoV-2, MERS-CoV ou HCoV-NL63 em MOI = 5 e fixadas em paraformaldeído a 4% a 96 hpi. As culturas foram preparadas para imagens de imunofluorescência, conforme descrito acima na seção 6 do protocolo, usando anticorpos primários contra cada proteína do nucleocapsídeo do vírus (mostrada em vermelho), marcador de células ciliadas tipo IV β-tubulina (verde) ou marcador de células caliciformes MUC5AC (verde). Vale ressaltar que um anticorpo contra a proteína não estrutural 8 do MERS-CoV (nsp8) foi usado no lugar de um anticorpo contra a proteína do nucleocapsídeo devido à incompatibilidade da espécie com o anticorpo MUC5AC. A colocalização entre o antígeno viral e cada um dos marcadores celulares epiteliais é visualizada como cor laranja/amarela em imagens mescladas para cada vírus. (B) As culturas nasais de LPA foram coradas com faloidina (que cora os filamentos citoesqueléticos da actina) para visualização da integridade do citoesqueleto, como demonstrado em rosa. A coloração de Hoescht é mostrada em azul. O painel 2B.1 mostra coloração nítida e intacta da faloidina, indicando arquitetura do citoesqueleto intacta, enquanto o painel 2B.2 mostra perda da integridade epitelial e borramento da coloração com faloidina. Barras de escala = (A) 50 μm, (B) 10 μm. Abreviações: ALI = interface ar-líquido; MOI = multiplicidade de infecção; HPI = horas pós-infecção. Esta figura foi construída usando dados publicados em Otter et al.

Figure 3
Figura 3: Medida da resistência elétrica transepitelial em culturas de LPA durante infecção. (A) Culturas nasais de LPA derivadas de 10 doadores foram infectadas simuladamente ou infectadas em MOI = 5 com SARS-CoV-2, MERS-CoV ou HCoV-NL63. O ΔTEER foi calculado para cada transwell como TEER a 192 hpi menos TEER a 0 hpi (TEER basal). Cada barra ilustra o valor médio de ΔTEER para cada vírus entre as culturas triplicadas de cada doador. (B) Culturas nasais de LPA derivadas de 8 doadores foram simuladas ou infectadas com HCoV-229E em MOI = 5. O ΔTEER a partir do TEER basal foi calculado como em (A) usando TEER a 96 hpi ou 192 hpi. (C,D) Os dados de rastreamento TEER são descritos para culturas infectadas com simulados ou infectados com HCoV derivados de cada um dos quatro doadores. Cada linha representa os dados TEER de uma única transwell ao longo do tempo (foram ensaiadas as transwells triplicadas de cada doador). Os números dos doadores são codificados por cores e mostrados na chave à direita de cada gráfico. Os dados são exibidos como média ± DP no painel A e no painel B. Abreviações: ALI = interface ar-líquido; MOI = multiplicidade de infecção; HPI = horas pós-infecção; TEER = resistência elétrica transepitelial. Esse valor foi construído com base nos dados publicados em Otter et al.1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Quantificação da citotoxicidade durante a infecção pelo HCoV em culturas nasais de LPA. Culturas nasais derivadas de 10 doadores infectados com cada HCoV em triplicata no MOI = 5 foram submetidas à quantificação de LDH em amostras de ASL, como descrito acima. A citotoxicidade média entre todos os doadores testados é mostrada para cada HCoV a 96 hpi e 192 hpi. Os dados são apresentados como média ± DP. Abreviações: ALI = interface ar-líquido; MOI = multiplicidade de infecção; HPI = horas pós-infecção; TEER = resistência elétrica transepitelial; ASL = líquido superficial apical; LDH = lactato desidrogenase. Esse valor foi construído com base nos dados publicados em Otter et al.1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análise de RNAm/proteína após infecção de culturas nasais. Culturas nasais tratadas com a citocina tipo 2 IL-13 ou sham-tratadas foram utilizadas para avaliar alterações na expressão dos receptores do HCoV, bem como em marcadores de células ciliadas e caliciformes. (A) A expressão de RNAm de DPP4 e ACE2 foi quantificada via RT-qPCR. Os dados para culturas de três doadores tratados com IL-13 são mostrados como alterações de dobra em relação a culturas tratadas com simulação derivadas dos mesmos doadores. Os dados são apresentados como média ± DP, sendo que cada ponto representa a indução média de mudança de dobra para um único doador. (B) A proteína total foi colhida de culturas nasais que foram tratadas com simulação ou IL-13 e infectadas por simulacro ou SARS-CoV-2. As proteínas foram separadas via SDS-PAGE e imunoblotadas com anticorpos contra marcadores de células epiteliais (tipo IV β-tubulina, MUC5AC), receptores HCoV (ACE2, DPP4), proteína de nucleocapsídeo SARS-CoV-2 e GAPDH. Abreviações: RT-qPCR = reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa; SDS-PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio. Esse valor foi construído com base nos dados publicados em Otter et al.1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os métodos aqui detalhados descrevem um sistema primário de cultura epitelial no qual células epiteliais nasais derivadas do paciente são cultivadas em uma interface ar-líquido e aplicadas ao estudo das interações HCoV-hospedeiro. Uma vez diferenciadas, essas culturas nasais de LPA recapitulam muitas características do epitélio nasal in vivo , incluindo uma população celular heterogênea com células ciliadas, caliciformes e basais representadas, bem como função mucociliar intacta com cílios e secreção de muco batendo robustamente. Essa população heterogênea de células é um dos principais benefícios desse sistema de cultura em relação às linhagens celulares epiteliais respiratórias tradicionais, pois permite a caracterização do tropismo da célula hospedeira durante a infecção viral (como mostrado na Figura 2). As linhagens celulares epiteliais tradicionais das vias aéreas também carecem de mecanismos funcionais de depuração mucociliar, que desempenham papéis-chave na defesa primária contra vírus respiratórios ao lado de vias imunes inatas, como a produção de interferon.

As etapas críticas dentro do protocolo incluem o procedimento inicial de infecção; Por exemplo, as culturas devem ser equilibradas na temperatura desejada antes da infecção, e uma metodologia consistente deve ser usada para iniciar cada infecção. Essas etapas são fundamentais para padronizar o método e garantir a reprodutibilidade dos achados a jusante.

Talvez a parte mais importante desses métodos seja a quantificação do vírus liberado apicamente, pois entender o ciclo de replicação exclusivo de cada HCoV ajuda a determinar os pontos de tempo que podem ser melhores para análises posteriores. As técnicas de imunofluorescência descritas acima também são críticas, pois a capacidade de visualizar infecções virais em um epitélio nasal in vitro com uma população celular heterogênea representativa permite uma avaliação precisa do tropismo viral e fornece a capacidade de consultar ainda mais as interações vírus-hospedeiro em um ambiente fisiológico.

O epitélio nasal é o principal sítio de barreira encontrado por todos os vírus respiratórios e, portanto, é provável que as infecções por HCoV comecem com infecção primária do epitélio nasal, com potencial de disseminação para a via aérea inferior através de um eixo de aspiração oropulmonar. Isto provavelmente desempenha um papel no desenvolvimento de pneumonia grave e doença respiratória durante a infecção patogénica do HCoV (MERS-CoV, SARS-CoV-2), enquanto os HCoVs sazonais tendem a causar doença apenas nas vias aéreas superiores. É fundamental entender as interações HCoV-hospedeiro neste importante sítio imune-sentinela, e este sistema ALI nasal permite caracterizar a replicação viral, o tropismo da célula hospedeira, bem como a citotoxicidade e a indução imune inata durante a infecção pelo HCoV.

Este sistema de cultura de LPA nasal também é altamente adaptável e pode ser usado para espelhar muitos estados clínicos da doença. Espécimes nasais adquiridos de pacientes com doenças pulmonares genéticas, como fibrose cística (causada por defeito dos canais de cloreto) ou discinesias ciliares primárias (nas quais os mecanismos de batimento ciliar são disfuncionais), podem ser usados para cultivar culturas nasais de LPA representativas dessas patologias, a fim de entender como esses pacientes podem ser diferencialmente afetados pela infecção pelo HCoV31,32. Além disso, vários tratamentos com citocinas podem ser usados durante a diferenciação de culturas nasais de LPA para recriar características de outros estados patológicos. Por exemplo, o tratamento com IL-13 durante a diferenciação induz hiperplasia de células caliciformes e pode ser usado como substituto para o estudo de vias aéreas asmáticas ou alérgicas33,34. Assim, este sistema de LPA nasal é uma ferramenta poderosa para sondar HCoV-hospedeiro, bem como outras interações vírus-hospedeiro, tanto em vias aéreas nasais saudáveis quanto doentes.

Embora este sistema proporcione muitas vantagens, algumas limitações também surgem com o uso de culturas nasais de LPA. Embora as células nasais exijam técnicas muito menos invasivas de aquisição do que as células brônquicas ou pulmonares, o crescimento e a diferenciação de culturas de LPA requerem significativamente mais tempo e recursos do que o uso de linhagens celulares imortalizadas tradicionais. Além disso, a variabilidade doador-doador em termos de permissividade à infecção, bem como as respostas do hospedeiro à infecção pelo HCoV, pode dificultar a reprodução e interpretação dos dados (é por isso que experimentos são frequentemente conduzidos com culturas derivadas de 5-10 doadores, a fim de mitigar esses problemas).

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Disclosures

Susan Weiss faz parte dos Conselhos Consultivos Científicos da Ocugen. Noam A. Cohen é consultor da GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron e Oyster Point Pharmaceuticals e tem uma patente nos EUA, "Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection" (10.881.698 B2, WO20913112865), e um acordo de licenciamento com a GeneOne Life Sciences.

Acknowledgments

Este estudo tem as seguintes fontes de financiamento: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. e N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. e N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. e N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) Invitrogen Various
BSA (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich A7906
cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor Roche 11836170001
Cytotoxicity detection kit Roche 11644793001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) Gibco 11965-084
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Gibco 14190136
DPBS + calcium + magnesium Gibco 14040-117
Endohm-6G measurement chamber World Precision Instruments ENDOHM-6G
Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) eBiosciences 14-9326-82
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) World Precision Instruments 300523
FBS (Fetal Bovine Serum) HyClone SH30071.03
FV10-ASW software for imaging Olympus Version 4.02
HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) BEI Resources NR-470
HCoV-NL63 nucleocapsid antibody Sino Biological 40641-V07E
Hoescht stain Thermo Fisher H3570
Laemmli sample buffer (4x) BIO-RAD 1610747
LLC-MK2 cells ATCC CCL-7 To titrate HCoV-NL63
MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) BEI Resources  NR-44260
MERS-CoV nucleocapsid antibody Sino Biological 40068-MM10
MUC5AC antibody Sigma-Aldrich AMAB91539
Olympus Fluoview confocal microscope Olympus FV1000
Phalloidin-iFluor 647 stain Abcam ab176759
PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)  Roche PHOSS-RO
Plate reader  Perkin Elmer HH34000000 Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm
RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) Thermo Fisher 89990 Can prep in-house or purchase
RNeasy Plus Kit Qiagen 74134
SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) BEI Resources NR-52281
SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody Genetex GTX135357
Triton-X 100 Fisher Scientific BP151100
Type IV β- tubulin antibody Abcam ab11315
VeroCCL81 cells ATCC CCL-81 To titrate MERS-CoV
VeroE6 cells ATCC CRL-1586 To titrate SARS-CoV-2

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References

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Infecção Células epiteliais nasais primárias Interface ar-líquido Coronavírus humano Interações do hospedeiro SARS-CoV MERS-CoV SARS-CoV-2 HCoV-NL63 HCoV-229E HCoV-OC43 HCoV-HKU1 Trato respiratório Epitélio nasal Amostras nasais derivadas do paciente Interações patógeno-hospedeiro Vias aéreas Função ciliar Produção de muco Replicação viral Tropismo de células hospedeiras Citotoxicidade induzida por vírus Indução imune inata Terapêutica antiviral
Infecção de Células Epiteliais Primárias Nasais Cultivadas em Interface Ar-Líquido para Caracterizar Interações Coronavírus-Hospedeiro Humano
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