Summary
Merkezi sinir sistemi (MSS) tümörleri, çocuklarda kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir ve lokorejyonel bağışıklık temelli tedaviler, klinik çalışmalardaki hastalar için giderek daha fazla test edilmektedir. Bu protokol, MSS tümörlerini hedef alan immünoterapötik infüzyonların preklinik değerlendirmesi için farelerde lokorejyonel kanül implantasyonu yöntemlerini açıklamaktadır.
Abstract
Pediatrik SSS tümörleri, çocuklarda kansere bağlı ölümlerin çoğundan sorumludur ve kemoterapi ve radyoterapideki ilerlemelere rağmen kötü prognozlara sahiptir. Birçok tümör etkili tedavilerden yoksun olduğundan, immünoterapiler gibi daha umut verici terapötik seçenekler geliştirmek için çok önemli bir ihtiyaç vardır; CNS tümörlerine yönelik kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücre tedavisinin kullanımı özellikle ilgi çekicidir. B7-H3, IL13RA2 ve disialoganglioside GD2 gibi hücre yüzey hedefleri, çeşitli pediatrik ve yetişkin CNS tümörlerinin yüzeyinde yüksek oranda eksprese edilir ve bu ve diğer yüzey hedeflerine karşı CAR T hücre tedavisini kullanma fırsatını arttırır. Preklinik murin modellerinde CAR T hücrelerinin tekrarlanan lokorejyonel dağıtımını değerlendirmek için, şu anda insan klinik çalışmalarında kullanılmakta olan yerleşik kateterleri özetleyen bir yerleşik kateter sistemi kurulmuştur. Stereotaktik teslimatın aksine, yerleşik kateter sistemi, birden fazla ameliyat kullanılmadan tekrarlanan dozlamaya izin verir. Bu protokol, pediatrik beyin tümörlerinin ortotopik murin modellerinde seri CAR T hücre infüzyonlarını başarılı bir şekilde test etmek için kullanılan sabit bir kılavuz kanülün intratümöral yerleşimini açıklamaktadır. Farelerde tümör hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu ve engraftasyonunu takiben, stereotaktik bir aparat üzerinde sabit bir kılavuz kanülün intratümöral yerleşimi tamamlanır ve vidalar ve akrilik reçine ile sabitlenir. Tedavi kanülleri daha sonra tekrarlanan CAR T hücre dağıtımı için sabit kılavuz kanülden yerleştirilir. Kılavuz kanülün stereotaktik yerleşimi, CAR T hücrelerini doğrudan lateral ventriküle veya beynin diğer yerlerine iletmek için ayarlanabilir. Bu platform, CAR T hücrelerinin tekrarlanan intrakraniyal infüzyonlarının ve bu yıkıcı pediatrik tümörler için diğer yeni terapötiklerin klinik öncesi testleri için güvenilir bir mekanizma sunmaktadır.
Introduction
Kemoterapi, radyoterapi ve cerrahideki gelişmelere rağmen, santral sinir sistemi (SSS) tümörleri pediatri1'deki en ölümcül malignitedir ve daha başarılı sonuçlara sahip yeni yaklaşımlara duyulan önemli bir ihtiyacın altını çizmektedir. İmmünoterapi alanındaki önemli ilerlemelerle birlikte, adoptif hücresel tedavi (ACT) yaklaşımları çeşitli kanserlerde, özellikle hematolojik malignitelerde umut verici sonuçlar göstermiştir2. Spesifik bir ACT türü olan kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücresi tedavisi, tümör hedefli T hücreleri üretmek için T hücrelerinin özgüllüğünü yeniden yönlendirerek bağışıklık sisteminin zararlı hücreleri tanıma ve öldürme konusundaki doğal yeteneğinden yararlanır3. CAR T hücre tedavisi, lösemi ve lenfomaların4 tedavisinde önemli başarılar göstermiş, umut verici bir immünoterapötik yaklaşım haline gelmiş ve solid tümörlerde araştırılmasını teşvik etmiştir. Bununla birlikte, şimdiye kadar, solid tümörlerde CAR T hücre tedavisi çok az klinik başarı elde etmiştir ve verimsiz tümör penetrasyonu, sınırlı hedeflenebilir antijenler ve baskılayıcı tümör mikroçevresi5 gibi birçok zorlukla karşı karşıyadır.
Son klinik çalışmalar, pediatrik CNS tümörleri için CAR T hücre tedavisini değerlendirmeye başlamış, ön raporlarda kavram kanıtı ve T hücre aktivitesinin erken kanıtını sağlamıştır 6,7,8. İlk klinik öncesi verilerin çoğu, CAR T hücrelerinin intravenöz verilmesine odaklanırken, son klinik öncesi kanıtlar, CNS 9,10'da lokorejyonel teslimatın üstünlüğünü ortaya koymuştur ve bu da birkaç klinik çalışmada başarıyla kullanılmıştır 6,7,8,11 . Bugüne kadar CNS'de CAR T hücrelerinin lokorejyonel dağıtımını içeren preklinik çalışmalar, stereotaktik olarak 9,10 verilen tek bir intrakraniyal CAR T hücresi dozuna dayanmaktadır. Bununla birlikte, insanlarda yapılan klinik çalışmalar, CNS 6,7,8,11'de CAR T hücrelerinin tekrarlanan infüzyonlarını gerektirmiş ve klinik öncesi gelişimde çoklu tekrarlanan infüzyonların değerlendirilmesi ihtiyacının altını çizmiştir. Bu prosedürün amacı, pediatrik beyin tümörlerinin ortotopik murin modellerinde bir kateter kullanarak seri CAR T hücre infüzyonlarını başarılı bir şekilde test etmektir. Bu tekniğin avantajı, tekrarlanan intra-CNS tedavilerini sağlamak için çoklu cerrahi prosedürlerden kaçınılmasıdır. Kanüller öncelikle nörotransmitterlerin mikrodiyaliz örneklemesi ve nörobilimde nöroaktif maddelerin verilmesi ve kemirgenlerde davranışsal araştırmalar için kullanılmıştır12, anti-kanser terapötiklerinin verilmesi için kullanımlarının sınırlı raporlarıyla. Önceki raporlara dayanarak, bu protokol, CNS tümörlerinin ksenograft murin modellerinde CAR T hücrelerini iletmek için stereotaktik olarak yerleştirilmiş bir konut kanül sistemi kullanır. Protokol, nörolojik veya nöro-onkolojik bozuklukların murin modellerinde ek terapötikleri test etmek için kullanılabilir ve kan-beyin bariyerini atlamanın etkinlik için kritik olduğu yeni terapötikleri test etmek için yararlı olabilir.
Protocol
Tüm protokol prosedürleri, AAALAC tarafından akredite edilen Philadelphia Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IAC 19-000907) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada ortotopik ksenogreft tümörleri olan 6-12 haftalık NOD scid gama (NSG) fareleri kullanılmıştır; Bununla birlikte, protokol herhangi bir fare gerginliğinde kullanılabilir. NSG fareleri steril bariyer koşullarında barındırıldı ve steril biyogüvenlik kabinleri altında ameliyat yapıldı. Tümör hücreleri veya T hücreleri gibi insan materyalleri kullanıldığında, prosedürler ve elleçleme ABSL-2 biyogüvenlik kabinlerinde tamamlanmalıdır.
1. Fareyi ameliyat için hazırlama
- Fareyi izofluran içeren bir indüksiyon odasında (%2-4) yeterli anestezi düzlemine ulaşılana kadar (yaklaşık 5 dakika) 1 L/dak oksijen akış hızında uyuşturun.
- Fareyi en yakın 0,1 g'a kadar bir terazi kullanarak tartın ve deri altı yavaş salınımlı (SR), buprenorfin (1 mg/kg) veya başka bir analjezik uygulayın.
NOT: SR buprenorfin 72 saat boyunca analjezi sağlar. - Farenin başının üstündeki kürkü elektrikli makaslar veya tüy dökücü maddeler kullanarak tıraş edin.
- Stereotaktik kolun altını yavaşça açmak için bir spatula kullanın ve forseps kullanarak kılavuz kanülü yerleştirin. Kanülü sabitlemek için koldaki vidayı sıkın, böylece kanülün beyaz plastik kısmının yaklaşık 1/2 ila 2/3'ü, kanülün 5 mm'lik metal uzunluğunun tamamı ile birlikte açıklığın dibinden çıkıntı yapar.
- Farenin üst dişlerini stereotaksik aparatın ısırık çubuğuna yerleştirin ve sabitleyin. Burun konisini öne doğru çekin ve farenin izofluran soluduğundan emin olarak sıkın.
- Fareyi ısıtılmış stereotaksik aparata kulak manşetleri veya kulak çubukları kullanarak aşırı basınçtan kaçınarak monte edin.
NOT: Isıtılmış tepsiye rektal termometre takılı olmalı ve ısıtma tepsisi, işlem sırasında farenin normal vücut sıcaklığını koruyacak şekilde ayarlanmalıdır. - Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak her iki göze steril oftalmik merhem uygulayın.
- Cerrahi bölgeyi bir ped veya aplikatör üzerinde povidon-iyot ile silin, ardından bir alkol pedi ile silin. Bu adımı toplamda üç kez gerçekleştirin.
- Prosedüre başlamadan önce, yeterli sedasyonu değerlendirmek için forseps ile bir parmak tutamağı uygulayın.
2. Cerrahi prosedür
NOT: Cerrahi prosedürün tüm yönlerinde sterilize edilmiş aletler ve aseptik teknikler kullanılmaktadır. Fareler işlem süresince yaklaşık 10-20 dakika olmak üzere izofluran (%2-4) ile anestezi altında devam eder.
- Forseps ile kulaklar arasındaki kafa derisini yavaşça alın. Steril makas kullanarak, kaldırılan kafa derisini kafatasına paralel olarak kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için oval bir cilt kapağını (0.75-1 cm uzunluğunda) çıkarın.
NOT: Makas, temiz, oval şekilli bir açıklık sağlamak ve çevredeki cilt ve dokuya gereksiz zarar gelmesini önlemek için neşter yerine tercih edilir. - Gerektiğinde aşırı kanamayı yavaşlatmaya yardımcı olmak için bir neşter veya pamuk uçlu çubuklar ve hemostatik bir pamuk pelet kullanarak fasyayı uzaklaştırın.
NOT: Steril bir pamuk ucunun ahşap tarafını kullanmak da fasyayı uzaklaştırabilir ve aşırı kanamayı önlemeye yardımcı olabilir. - Bregma ve lambda yer işaretlerini, kafatası üzerindeki kafatası üzerindeki ön ve arka işaretleri tanımlayın13.
NOT: Açıkta kalan kafatasının üst kısmı hidrojen peroksit ile silinerek tanımlama artırılabilir. - Akriliğin tutturacağı bir yüzey oluşturmak için kafatasını bir neşter kullanarak yavaşça puanlayın. Puanlama, birbirine 90° açılarda yaklaşık 0,5-1 cm uzunluğunda birden fazla doğrusal çizgi içermelidir.
- Stereotaksik kolu kullanarak, kanülü ilgi çekici yere (bregma veya lambda) lokalize edin. Lokalize olduktan sonra, kanül ucunu kafatası yüzeyinin 1-2 mm üzerine kaldırın ve istenen koordinatlara hareket edin. İntratümöral enjeksiyonlar için bu, tümör yerleşimi ile aynı A / P ve M / L koordinatlarını kullanır.
- Açıkta kalan kafatasında, kanülün gireceği alandan uzakta, 18 G iğne veya cerrahi matkapla iki vida deliği açın. Deliklerin kanül için yeterli alan içerecek şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Bir matkap ucu kullanarak, kafatasına yakalanana kadar vida deliklerini döndürün. Düz uçlu bir tornavida kullanarak iki vidayı deliklere yerleştirin ve sabitleyin. Ardından, sabitlendiklerinden emin olmak için vidaları yavaşça yukarı çekin.
NOT: Vidaları kafatası ile aynı hizaya gelene kadar takmayın, aksi takdirde altındaki fare beynine zarar verebilirler. Vida ve kafatası arasında en az 1-2 mm boşluk bırakın. - 18 G'lik bir iğne veya cerrahi matkap kullanarak, kanülün yerleştirilmesi için bir delik oluşturmak üzere kafatasını belirlenen koordinatlarda delin.
- Stereotaktik kolu kullanarak, kanülü istenen D / V koordinatına indirin.
NOT: Kanül implantasyonunun D/V koordinatı, kukla ve tedavi kanüllerinin projeksiyon uzunluğunu hesaba katmalıdır ve tümör hücrelerinin ortotopik enjeksiyonundan daha yüzeysel olabilir (Şekil 1). - Porselen 12 delikli bir plakada, bir kuyucuğu akrilik reçine tozu (yaklaşık 0.3 g) ve 10-15 damla (yaklaşık 0.5-0.75 mL) akrilik reçine sıvısı ile doldurun. Bu viskoz beyaz renkli bir malzeme üretir. Karışımı 1 mL'lik bir şırıngaya çekin ve kafatasını kaplamak ve örtmek için kullanın, kanül ve vidaların etrafındaki boşlukları doldurun.
NOT: Viskoz malzeme zamanla çimento halinde sertleşir, bu nedenle bu adım karıştırıldıktan hemen sonra tamamlanmalıdır. - Çimento hala esnek olsa da, stereotaktik koldaki vidayı gevşetin ve kanülü tutucudan yavaşça serbest bırakmak ve stereotaktik kolu fareden yavaşça yukarı doğru geri çekmek için alttaki açıklıkta bir spatula kullanın.
- Çimento tamamen kuruduktan sonra, kukla kanülü kılavuz kanülüne yerleştirin ve saat yönünde çevirerek sıkıca sabitleyin.
- İşlem tamamlandıktan sonra, dikkatlice izlemek için fareyi ısıtılmış ev kafesine geri yerleştirin, yeterli iyileşmeyi sağlayın ve koloniye dönmeden önce farenin bilincini tamamen geri kazanması da dahil olmak üzere prosedür sonrası gözlemleri kaydedin.
NOT: Aşırı ısınmayı önlemek için hayvanın soğutucu tarafa geçmesine izin vermek için genellikle kafesin sadece yarısını bir ısıtma yastığına yerleştirmeniz önerilir. - Fareler ameliyat sonrası ağrının göstergesi olan davranışlar sergilerse, örneğin 3 güne kadar günde bir kez deri altından verilen meloksikam 5 mg / kg gibi gerektiğinde ek analjezikler uygulayın.
3. CAR T hücrelerinin hazırlanması
- Bir hücre sayacı kullanarak önceden transfekte edilmiş CAR T hücre konsantrasyonunu ölçün.
- Önceden transfekte edilmiş T hücrelerini oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
- Bir vakum aspirasyon sisteminde steril bir Pasteur pipet kullanarak süpernatantı aspire edin ve peleti fosfata tamponlu salin (PBS) içinde istenen konsantrasyona geri getirin. Tipik dağıtım hacimleri 2-5 μL'dir. Tipik hücre dozları 0.5-5 x 106 hücredir.
4. CAR T hücre infüzyonları
- Üst kısmı küçük bir PKG tüp parçasından besleyerek tedavi kanülünü hazırlayın.
- Tedavi şırıngasını CAR T hücresi süspansiyonu ile doldurun ve tedavi kanülünün üstünü kaplayacak kadar PKG tüpünün diğer ucundan yerleştirin.
- Fareyi izofluran (%2-4) ile 1 L/dak oksijen akış hızında uyuşturun.
- Kılavuz kanülü tabandaki forsepsleri kullanarak stabilize edin ve ardından kılavuz kanüle erişime izin vererek kukla kanülü dikkatlice sökün ve çıkarın.
NOT: Stereotaksik bir kurulum gerekli değildir, ancak tedavi için kafayı stabilize etmek için kullanılabilir. - CAR T hücrelerini 1 dakika boyunca infüze edin ve infüzyonun kesilmesini takiben tedavi kanülünü 1 dakika daha yerinde tutun.
- Tedavi kanülünü çıkarın ve kukla kanülü sıkıca yerine vidalayın.
- İsteğe bağlı ağrı kontrolü için subkutan meloksikam (5 mg / kg) uygulayın.
Representative Results
Fare CNS'sine başarılı kanül implantasyonu
Başarılı kanülasyona sahip fareler, günlük yaşam aktivitelerine müdahale etmeyen (Şekil 2A) ve bir tedavi kanülünü kolayca geçebilen ve direnç göstermeden sıvı verebilen güvenli bir kılavuz kanüle sahiptir (Şekil 2B). Deneyimlerimize göre, kanüllerin çoğunluğu 4 haftadan fazla bir süre yerinde kalır, ancak% 0-25'i zamanla yerinden çıkabilir. Doğru yerleşimin doğrulanması, kanül içine enjekte edilen Evans mavi boyası ile doğrulanabilir. Örneğin, lateral ventriküle yerleştirilen bir kanül, serebral omurilik sıvısından geçerken ventriküler sistem boyunca Evans mavi boyasını gösterir ve doğru yerleşimi onaylar (Şekil 2C). Tümöre yerleştirilen kanüller, tümör implantasyon bölgesinde Evans mavi boyasını gösterir.
Ksenograft tümörlerinin tedavisi için CAR T hücrelerinin CNS'ye etkili bir şekilde verilmesi.
İntrakraniyal kanül sisteminin etkinliği ve murin modellerinde CAR T hücrelerinin terapötik etkinliği, biyolüminesan görüntüleme ve genel sağkalım dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalarla ölçülebilir. GPC2'ye yönelik CAR T hücreleri, belirtilen intrakraniyal kanül sistemi14 aracılığıyla tekrarlanan CAR T hücre dozlaması kullanılarak, sırasıyla 7316-4509 ve 7316-3058 numaralı murin medulloblastom ve diffüz orta hat glioma modellerine karşı test edildi. Ortotopik tümör yerleşimi ve engraftmanı biyolüminesan görüntüleme ile doğrulandı ve ortotopik tümör yerleşimi ile aynı koordinatlar kullanılarak tümör yatağına kanüller yerleştirildi. Tedaviler, 2-4 hafta boyunca haftada bir ila iki kez GPC2 CAR T hücre infüzyonlarından oluşuyordu ve toplam dört ila altı dozdu. Tedaviyi takiben, GPC2'ye yönelik CAR T hücre tedavisi, medulloblastoma model 7316-4509'da (p < 0.01) belirgin tümör regresyonuna (Şekil 3A) ve talamik diffüz orta hat glioma 7316-3058'de (p < 0.05) anlamlı derecede uzamış sağkalıma neden olmuştur (Şekil 3B)14.
Resim 1: Projeksiyon mankenli kılavuz kanül ve tedavi kanülleri. (A) 0,5 mm projeksiyonlu kılavuz kanül ve 2 mm projeksiyon kukla kanülleri yerinde. (B) 0,5 mm projeksiyonlu kılavuz kanül ve 2 mm projeksiyon tedavi kanülleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CAR T hücrelerinin tekrarlanan dozları için tedavi kanül dağıtım sistemi. (A) Kullanılmadığı zamanlarda bir kapak yerinde olacak şekilde bir fare kafatasına implante edilen kanül. (B) Fare anestezi altındayken tedavi kanülü yoluyla CAR T hücrelerinin bir pontin tümörüne infüzyonu. (C) Evans mavi boyası kullanılarak lateral ventriküle kanül yerleşiminin doğrulanması. Boya kanülden sokuldu, ardından ötenazi ve beyin eksizyonu yapıldı, ventriküller boyunca boya mevcuttu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: GPC2 yönelimli CAR T hücreleri, antitümör yanıtlara aracılık eder ve pediatrik beyin tümörlerinde in vivo sağkalımı uzatır. (A) GPC2 veya CD19 yönelimli mRNA CAR T hücreleri ile tedavi edilen ortotopik grup 4 medulloblastoma ksenograft 7316-4509'un biyolüminesansının miktarının belirlenmesi. Dozlar grafikteki oklarla gösterilir. SD ile ortalama olarak görüntülenen veriler, n = kol başına 9-11 fare. (B) Talamik DMG ksenograft 7316-3058 ile implante edilen farelerin genel sağkalımı, altı tekrarlanan doz 2 x 106 CAR T hücresi ile tedavi edilir. Dozlar grafikteki oklarla gösterilir. n = kol başına 7 fare. **p < 0,01; *p < 0,05; ns = önemli değil. Bu rakam Foster ve ark.14'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
CAR T hücre tedavisi hematolojik kanserlerin tedavisinde devrim yaratmıştır ve katı beyin tümörlerinin tedavisinde umut verici bir değer göstermektedir 6,7,8. Bu protokol, pediatrik SSS tümörlerinin tedavisi için lokorejyonel CAR T hücre dağıtımının preklinik değerlendirmesini sağlamak üzere tasarlanmıştır. Kanül sistemi, pediatrik CNS tümörlerinde CAR T hücre tedavisinin devam eden klinik çalışmalarında halen kullanılmakta olan bir intraventriküler kateter sistemi olan bir Ommaya veya Rickham rezervuarını çoğaltır 6,7,8, bu yöntemlerin alaka düzeyini ve translasyonel potansiyelini vurgulamaktadır. Bu sistem, yine devam eden klinik çalışmalarda kullanılan yöntemlere benzer şekilde, kan-beyin bariyerini atlayan CAR T hücrelerinin tekrar tekrar verilmesine izin verir. Lokorejyonel doğum, CNS9'da maksimum etkinlik sağlayabilir ve ayrıca dolaşımdan kaynaklanan kaçakçılıkla ilişkili sistemik toksisite riskini azaltabilir15. Stereotaktik dağıtım CNS'ye tek bir doz sağlayabilirken, bu sistemin avantajı, birden fazla ameliyata gerek kalmadan CNS'de belirli bir yere çoklu tekrarlanan dozlar sağlama fırsatıdır. Bu prosedürün sınırlamaları, kanül yerleştirildikten sonra yer değiştirme veya ayarlamalar yapma yeteneği olmayan sabit bir teslimat bölgesini ve kanülün yerinden çıkma potansiyelini içerir.
Bu protokoldeki kritik bir adım, sabit kılavuz kanülün, tedavi kanüllerinin projeksiyonunu dikkate alan bir D / V koordinatında implante edilmesidir. Tedavi kanülü, kılavuz kanülün ucunun dışına taşacaktır ve bu nedenle yerleştirmenin CAR T hücrelerinin ilgili bölgeye verilmesiyle sonuçlanacağından emin olmak için özen gösterilmelidir. Tedavi kanülünün projeksiyon uzunlukları özelleştirilebilir ve yazarın deneyimlerine göre, 0,5 mm yararlı bir projeksiyon uzunluğudur. Bu uzunluk, tedavinin dağıtım sırasında kılavuz kanülde kalmamasını sağlar, ancak aynı zamanda kılavuz kanül için D / V koordinatlarının ilgili bölgeye önemli ölçüde ayarlanmasını gerektirmez. Bu protokoldeki bir diğer önemli adım, CAR T hücre infüzyonunu takiben tedavi kanülünün yerinde bırakıldığı zamandır. Tedavi kanülü, sızıntıları ve CAR T hücre tedavisinin lokorejyonel dağıtımının kaybını önlemek için infüzyonun bitiminden sonra en az 1 dakika boyunca yerinde tutulmalıdır.
Bu yöntemin sorunlarını gidermek basittir, çoğu komplikasyon muhtemelen kılavuz kanülün iç kısmındaki kurumuş kan nedeniyle, kukla kanülün çıkarılmasında veya tedavi kanülünün sabit kılavuz kanülüne yerleştirilmesinde zorluk yaşanır. Bu, kukla kanülü kılavuz kanülden daha az direnç olana ve enkaz temizlenene kadar yavaşça geçirerek kolayca çözülebilir. Akrilik reçine bazen kafatasından yerinden çıkabilir ve kanül sisteminin kaybına neden olabilir. Deneyimlerimize göre, bu genellikle kafatasının bir neşterle puanlanması ve iki vidanın yerleştirilmesiyle sınırlıdır. Ek olarak, fare hareket halindeyken yanlışlıkla kanüle kuvvet uygulayabilecek kafesteki tüm öğeler, küçük açıklıklara sahip belirli fare zenginleştirme kulübeleri gibi çıkarılır.
Sonuç olarak, burada tarif edilen, CAR T hücrelerinin tekrarlanan teslimatı için CNS tümörlerinin murin modellerine bir kanül sisteminin yerleştirilmesi için bir protokoldür. Kanül yerleşimi, farklı dağıtım yerlerinin etkinliğini test ederek birden fazla lokorejyonel teslimat yerine ayarlanabilir. Ek olarak, bu sistem kan-beyin bariyerini atlarken etkinliği değerlendirmek için CAR T hücrelerinin ötesinde ek terapötikler için kullanılabilir ve ayrıca onkolojik olmayan bozuklukların murin modellerinde terapötiklerin değerlendirilmesi için de yararlı olabilir.
Disclosures
JBF, glipikan 2 (GPC2) odaklı immünoterapilerle ilgili bir patente sahiptir. Diğer tüm yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışmanın finansmanı Matthew Larson Vakfı, Grayson Saves Vakfı, Hyundai Hope on Wheels Genç Araştırmacı Ödülü, Kortney Rose Vakfı, Ulusal Sağlık Enstitüleri NCI K12 CA076931-19 ve 1K08CA263179-01 ve Savunma Bakanlığı W81XWH-21-1-0221 tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needles | BD | 511097 | 1 1/2 inch metal hub |
| Acrylic resin liquid | Lang Dental | B1323 | |
| Acrylic resin powder | Lang Dental | B1323 | |
| Alcohol wipes | BD | 326895 | |
| Centrifuge 5240 | Eppendorf | 5420000040 | Centrifuge |
| Cotton tipped swabs | Puritan | 826-WC | Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500) |
| Drill bit holder | P1 Technologies | DH-1 | Drill bit holder for D56-D70 |
| Drill bit | P1 Technologies | D58 | 1.07 mm |
| Dummy cannula | P1 Technologies | C315DCS-5/SPC | Configuration: Small cap; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
| Flat tip screwdriver | P1 Technologies | SD-80 | Screwdriver |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Forceps |
| Guide cannula | P1 Technologies | C315GS-5/SPC | Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal |
| Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine | Pascal | 1151602 | |
| MOXI Z Mini automated cell counter Kit | Moxi | MXZ001 | Cell counter |
| NOD scid gamma (NSG) mice | Jackson Laboratory | 5557 | 6 to 12-week-old males and females |
| Pasteur pipet | VWR | 14673-043 | |
| PKG tubing | P1 Technologies | C313CT | Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm |
| Porcelain 12 well plate | Flinn Scientific | AP6064 | |
| Povidone iodine | Medline | MDS093943 | |
| Scalpel | World Precision Instrument | 50-822-457 | Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6" Ruler |
| Screws | P1 Technologies | 0-80 X 3/32 | 2.4 mm |
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 940 | Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console |
| Student fine scissors | Fine Science Tools | 91460-12 | Scissors |
| Treatment cannula | P1 Technologies | C315IS-5/SPC | 33GA; Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
| Treatment syringes | Hamilton | 87908 | 5 µL, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5"/PT3 |
| Vactrap XL | Foxx Life Sciences | 305-4401-FLS | Vacuum System |
References
- Curtin, S. C., Minino, A. M., Anderson, R. N. Declines in cancer death rates among children and adolescents in the United States, 1999-2014. NCHS Data Brief. 257, 1-8 (2016).
- Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: the current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
- Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discovery. 3 (4), 388-398 (2013).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Wagner, J., Wickman, E., DeRenzo, C., Gottschalk, S. CAR T cell therapy for solid tumors: Bright future or dark reality. Molecular Therapy. 28 (11), 2320-2339 (2020).
- Vitanza, N. A., et al. Locoregional infusion of HER2-specific CAR T cells in children and young adults with recurrent or refractory CNS tumors: an interim analysis. Nature Medicine. 27 (9), 1544-1552 (2021).
- Majzner, R. G., et al. GD2-CAR T cell therapy for H3K27M-mutated diffuse midline gliomas. Nature. 603 (7903), 934-941 (2022).
- Vitanza, N. A., et al. Intraventricular B7-H3 CAR T cells for diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary first-in-human bioactivity and safety. Cancer Discovery. 13 (1), 114-131 (2023).
- Theruvath, J., et al. Locoregionally administered B7-H3-targeted CAR T cells for treatment of atypical teratoid/rhabdoid tumors. Nature Medicine. 26 (5), 712-719 (2020).
- Donovan, L. K., et al. Locoregional delivery of CAR T cells to the cerebrospinal fluid for treatment of metastatic medulloblastoma and ependymoma. Nature Medicine. 26 (5), 720-731 (2020).
- Brown, C. E., et al. Regression of glioblastoma after chimeric antigen receptor T-Cell therapy. The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Bourne, J. A. Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (1-2), 16-24 (2003).
- Zhou, P., et al. Automatically detecting bregma and lambda points in rodent skull anatomy images. PLoS One. 15 (12), 0244378 (2020).
- Foster, J. B., et al. Development of GPC2-directed chimeric antigen receptors using mRNA for pediatric brain tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (9), 004450 (2022).
- Akhavan, D., et al. T cells for brain tumors: Lessons learned and road ahead. Immunological Reviews. 290 (1), 60-84 (2019).
